分子生物学研究方法11

1、课件11第七章 分子生物学研究方法 Techniques of Molecular Biology第一节 基因操作第二节 主要载体系统第三节 基因的分离与鉴定第四节 基因表达研究技术第五节 DNA序列测定 第六节 蛋白质组学研究技术第一节 常见基因操作DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化核酸序列分析 核心技术基因的人工合成基因的定点突变PCR扩增等 DNA克隆概述（1）克隆概念：n 多细胞的高等生物个体水平上：同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。n 在细胞水平上：指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的

2、一群遗传上同一的子细胞群体。n DNA克隆（基因克隆）？ 从单一祖先产生同一的DNA分子群体的过程（2）重组DNA技术简单概括为：“分”目的基因的获取 “切”基因载体的选择与构建 “接”目的基因与载体的拼接 “转”重组DNA分子导入受体细胞 “筛”筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子 （转化子） 限制酶与电泳n 1962年Arber 发现限制性核酸内切酶n 1967Gellert发现了 DNA 连接酶n 工作原理图 限制性核酸内切酶(restriction enzyme)n 识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。n 分类：型、型、型。类酶识别序列特点为回文结构

3、。 GGATCC CCTAGG n 命名： EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)n 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 粘性末端(cohesive end)和钝性末端(blunt end)钝性末端(blunt end)限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。 同工异源酶：来源不同,但能识别和切割同一位点Hpa II -CCGG- Msp I -GGCC- 核酸的凝胶电泳（Gel electrophoresis） 基本原理： 电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型琼脂糖凝胶电泳（Agarose electrophoresis）n 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.25

4、0kb之间聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide electrophoresis）n 分辨能力强，但分辨范围窄(11000bp)。凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50 0001 0000.7%琼脂糖20 0001 0001.4%琼脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺501脉冲电场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis)大肠杆菌 冰冷的CaCl2 42C热击 筛选（预先处理的0C） 细菌转化(Transformation)a)概念： 指一种细菌菌株由于捕获

5、了另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。b)方法CaCl2 法c) 感受态细胞转化频率的计算方法：n 转化总数 = 菌落数（转化反应原液总体积/涂板 菌液体积）n 插入频率 = 白色菌落数/（白色菌落数 + 蓝色菌落数）n 转化频率（每gDNA转化菌落数）= 转化体总数/加入质粒DNA总量（g） DNA体外扩增技术 （polymerase chain reaction, PCR）n PCR基本原理n PCR三步曲5. 基因敲除技术及应用ForwardGenetics(1) 基因敲除的概念n 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，该技术通过外源DNA之间的同

6、源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性、染色体DNA与目的片段共同稳定遗传等特点。 完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。(2) 完全基因敲除策略n 在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略是置换型载体的正-负双选择（positive-negative selection, PNS）： 正向选择基因neor通常插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。该基因的表达可以抵抗G418对细胞的致死效应。 负向选择基因HSV-tk（human semian virus-th

7、ymidine kinase）则被置于目的片段外侧，使培养液中的丙氧鸟苷（ganciclovir,GANC）磷酸化，进而参与DNA复制并造成DNA复制的提前终止。（3）条件型基因敲除（Cre/LoxP 系统）第二节 分子克隆载体n 载体的概念: 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。n 载体特点： 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 安全性| 载体的种类1. 细菌质粒(克隆) 2. 噬菌体(克隆) 3. 柯斯质

8、粒(克隆) 4. 穿梭质粒(克隆/表达) 5. 细菌人工染色体(克隆/表达) 6. 酵母人工染色体(克隆/表达) 7. Ti质粒及其衍生载体(转化) 8. 哺乳动物病毒载体 质粒载体（plasmids as vectors）n 构成：ampr Tn3tetr pSC101Ori pMB1n 优点：较小的分子量选择记号较高的拷贝数b) pUC质粒载体n 构成： (i) ori pBR322 ； (ii) ampr； (iii) lacZ； (iv) MCS。n 优点： 更小的分子量和更高的拷贝数 MCS区段 -互补作用| 蓝白斑筛选 lacZ基因的插入失活 载 体：含有-半乳糖苷酶基因lacZ的

9、调控序列和头146 个aa的编码序列 宿 主：缺失了lacZ基因，可编码-半乳糖苷酶C端序列 -互补:lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以 与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶 隐性突变体之间实现互补。 在有IPTG，X-gal时，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。这一系统称为lac selection。c) pMD18-T质粒载体 噬菌体载体(Phages as Vectors) 左臂：AJ 中段：DNA整合和切出，溶原生长所需的序列 右臂：调控区 cos位点（cohesive-end site，粘性末端位点）（3）噬菌体载体种类a) 插入型载体 免疫功能失活插入型载体

10、外源DNA片段 免疫区 裂解周期 清晰噬菌 斑没有外源DNA插入 混浊的噬菌斑 -半乳糖甙酶失活插入型载体 含有lacZ区段载体感染lac-指示菌蓝色噬菌斑 lacZ区无外源片段插入白色噬菌斑 lacZ区有外源片段插入b) 替换型载体n 取代型即利用一段外源DNA去取代载体中的一段DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。n 有的取代型载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A 柯斯质粒载体 含有-DNA两端cos区的质粒第三节 基因的分离与鉴定 目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库； 另一类是利用PCR扩增技术

11、甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达 核酸探针克隆目的基因 mRNA差别显示技术分离克隆目的基因 cDNA差示分析法克隆基因 酵母双杂交体系克隆基因 基因的图位克隆法 基因文库的构建 a) 基因库与基因文库 特定生物体全基因组的集合（天然存在）叫gene pool 从特定生物个体中分离的全部基因为gene library or gene bank。这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为： l 基因组文库（含有全部基因）：材料来自染色体DNA l cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）：材料来自mRNAb）基因文库的完备性： 在构建的基因文库

12、中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )n： 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f：插入片短的平均大小与基因组DNA大小的比值（2）基因文库的构建程序a) 基因组DNA文库 存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。b) cDNA文库 用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c文库。（3）从基因文库中筛选目的基因（4）基因组文库重组克隆的排序n 酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法 应用mRNA差别显示技术分

13、离克隆目的基因根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类： 一类叫做看家基因 （house-keeping gene）； 一类叫做发育调控基因 （developmental regulated gene） 基因的差别表达（differential expression）：不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式。3. 抑制消减杂交(SSH) 4. 应用酵母双杂交体系克隆基因n 原理：真核生物转录因子包括两个结构域：5. 基因的图位克隆法第四节 基因表达研究技术n 基因表达系列分析技术n 原位杂交技术n 定点诱变技术n DNA微列阵技

14、术n RNA干涉技术1. DNA微列阵技术n 何为生物芯片? 生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。DNA Chip Technologyn Solid support (glass, plastic, metal, silicon)n Miniaturized array of DNA (genetic material)n Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybr

15、idizationn Hybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled(2)DNA芯片的主要类型按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA

16、(Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise) Research UseFrom Sequence to functionn 计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5)。在 0.5-2.0 之外的定义为在两

17、样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。n Clustering。(4) DNA芯片技术的应用DNA测序；杂交测序（SBH）基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水 平上检测致病基因的表达药物研究与开发： 应用之一 基因表达谱（gene expression pattern)n 表达芯片实例2. RNA interference Gene silencing by dsRNAn 植物：cosuppression (Rich Jorgensen, early 90s in 20th century )n 真菌： quelling (

18、Cogoni et al, 1994)n 动物： RNA interfering Guo and Kemphues(1994): 向秀丽线虫注射par-1基因的antisense RNA，结果减弱了此基因的表达。但是，对照组注射sense RNA，也得到同样结果？！RNAi现象的普遍性n 随后陆续发现RNAi也存在水稻、烟草、果蝇及人等所有的真核生物中。n RNAi能高效特医的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲处的效果。RNA-Mediated Gene Silencing（2）RNAi的作用机制：沉默信号的放大与传递RNAi放大信号Transcriptional Gene

19、 Silencingsmall-temporal RNAsRNA interference转基因沉默分为： 转录后水平的沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS) 转录水平的沉默（Transcriptional Gene Silencing，TGS) RNAi属于转录后水平的沉默沉默信号的放大与传递RNAi 在组织间的传递需要： A) 从一个细胞到另一个细胞 B) 信号进行放大A) SID, 穿膜蛋白 (为信号运输提供通道)B) RdRP - RNA依赖的RNA聚合酶 - 存在于有些生物中 (drosophila, plants) - 通过扩增富集

20、siRNA的浓度- siRNA 为引物，靶mRNA为模板，合成 ds siRNAG系统； pH 8.0 硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂 脱G A+G系统；pH 2.0 哌啶甲酸（pidine） 嘌呤环 N质子化 脱嘌呤 C系统； 1.5 mol/L NaCl C + 肼（hydrazine） 脱C T + C系统； 肼(hydrazine) 打开嘧啶环 重新5C环化脱嘧啶 二、 双脱氧法 三、 DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与

21、计算机输入 可自动化 2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相互间

22、会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自动化。Part II proteins2-1 specific proteins can be purified from cell extractsn The purification of individual proteins is critical to understanding their function. (why?)n Although there are thousands of proteins in a single cell, each

23、 protein has unique properties that make its purification somewhat different from others.n The purification of a protein is designed to exploit its unique characteristics, such as size, charge, shape, and in many instance, function.2-2 purification of a protein requires a specific assayn To purify a

24、 protein requires that you have an assay that is unique to that protein.n In many instance, its convenient to use a measure for the function of the protein, or you may use the antibody of the protein.n It is useful to monitor the purification process.2-4 Proteins can be separated from one another us

25、ing column chromatographyn In this approach, protein fractions are passed though glass columns filled with appropriated modified small acrylamide or agarose beads.n There are various ways columns can be used to separate proteins according to their characteristics. Ion exchange chromatographyn The pr

26、oteins are separated according to their surface charge.n The beads are modified with either negative-charged or positive-charged chemical groups.n Proteins bind more strongly requires more salt to be eluted. Gel filtration chromatography n This technique separate the proteins on the bases of size an

27、d shape. n The beads for it have a variety of different sized pores throughout.n Small proteins can enter all of the pores, and take longer to elute; but large proteins pass quickly.2-5 affinity chromatography can facilitate more rapid protein purificationn If we firstly know our target protein can

28、specifically interact with something else, we can bind this “something else” to the column and only our target protein bind to the column.This method is called affinity chromatography. Immunoaffinity chromatographyn An antibody that is specific for the target is attached to the bead, and ideally onl

29、y the target protein can bind to the column.n However, sometimes the binding is too tight to elute our target protein, unless it is denatured. But the denatured protein is useless.n Sometimes tags (epitopes) can be added to the N- or C- terminal of the protein, using molecular cloning method.n This

30、procedure allows the modified proteins to be purified using immunoaffinity purification and a heterologous antibody to the tag.n Importantly, the binding affinity can change according to the condition. e.g. the concentration of the Ca2+ in the solution.immunoprecipitationn We attach the antibody to

31、the bead, and use it to precipitate a specific protein from a crude cell extract.n Its a useful method to detect what proteins or other molecules are associated with the target protein. 2-6 separation of proteins on polyacrylamide gelsn The native proteins have neither a uniform charge nor a uniform

32、 secondary structure.n If we treat the protein with a strong detergent SDS, the higher structure is usually eliminated. And SDS confers the polypeptide chain a uniform negative charge.n And sometimes mercaptoethanol is need to break the disulphide bond.n Thus, the protein molecules can be resolved b

33、y electrophoresis in the presence of SDS according to the length of individual polypeptide.n After electrophoresis, the proteins can be visualized with a stain, such as Coomassie brilliant blue.2-7 antibodies visualize electrophoretically-separated proteins. n The electrophoretically separated prote

34、ins are transferred to a filter. And this filter is then incubate in a solution of an antibody to our interested protein. Finally, a chromogenic enzyme is used to visualized the filter-bound antibody 2-8 protein molecules can be directly sequenced n Two sequence method: Edman degradation & Tandem ma

35、ss spectrometry(MS/MS).n Due to the vast resource of complete or nearly complete genome, the determination of even a small stretch of protein sequence is sufficient to identify the gene.Edman degradationn Its a chemical reaction in which the amino acids residues are sequentially release for the N-terminus of a polypeptide chain.n Step 1: modify the N-terminal amino with PITC, which can only react with the free -amino group.n Step 2: cleave off the N-terminal by acid treatment, but the rest of the poly