长期低硒、低碘对子代发育期大鼠甲状腺形态结构及PCNA表达的影响

1、长期低硒、低碘对子代发育期大鼠甲状腺形态结构及PCNA表达的影响         08-11-29 13:35:00     作者：姜洋    编辑：studa20【摘要】  目的：研究长期低硒、低碘饲料喂养对子代发育期大鼠甲状腺组织形态结构以及PCNA表达的影响。方法：选取人工低硒、低碘饲料喂养繁殖的SD大鼠模型的仔3代胎鼠(F3E)、4日龄(F3P4)、21日龄(F3P21)、成年(F3A)4个时间点的甲状腺石蜡标本，常规

2、切片，苏木精_伊红染色，免疫组化染色，镜下观察，滤泡计数。动物模型分为对照组，低硒(Se-)组，低碘(I-)组和低硒、低碘(Se-I-)组，各组分别喂以不同硒、碘水平的人工配制饲料，繁衍至仔4代。取甲状腺，制做石蜡切片。结果：各发育期时间点I-组与Se-I-组甲状腺体积增大，重量增加，滤泡增生，排列紧密。这种增生现象从胎鼠期间即有出现。在成年大鼠Se-组甲状腺滤泡有坏死和纤维化。PCNA在Se-I-组与I-组均强阳性表达，强阳性表达百分比依次为成年Se-I-组50%，I-组286%。21d Se-I-组214%，I-组167%。结论：低碘和低硒、低碘均可致仔代发育期大鼠甲状腺滤泡明显增生。这种

3、增生现象在胚胎期即表现。低硒能引起部分仔代大鼠甲状腺滤泡的坏死与纤维化。 【关键词】  大鼠 缺硒 缺碘 甲状腺    AbstractObjective: To study the effects of longtime selenium(Se)and iodine(I)deficiency on histomorphology and PCNA expression of thyroid gland of rat at development stage. Methods: The paraffin specimens of thyroid glan

4、d of the third generation rats with the age of embryo(F3E), 4 days(F3P4), 21 days(F2P21), adult(F3A) as four time points of research subjects were chosen. The sections of paraffin specimens were hematoxylin_eosin stained and immunohistochemistry stained, and then observed under microscope. The folli

5、cles were counted under microscope. Healthy SD rats were divided into control group, Se_deficient group(Se- group), I_deficient group(I-group) and both Se_and I_deficient group(Se- I- group). The rats in each group were given the artificial feeds containing different levels of Se and I. These rats w

6、ere bred to the fourth generation. Results: At each research time points, the goiter was produced in I- group and Se-I- group and the thyroid weight and volume were increased between two groups. Under microscope, the features of small follicular proliferation were observed. The number and density of

7、 follicles were increased. The volume of follicles, the surface and the thyroid colloid of follicle cavity were decreased. These features were observed in I- group and Se-I- group of each time points. The follicular necrosis and fibrosis were observed in Se- group of adult rat. The strong expression

8、 of PCNA occurred in Se-I- group and Se- group, Se-I- group 500%, I- group 286% in adult, Se-I-214%, I-167% in 21_day. Conclusion: Simple selenium deficiency does not induce the thyroid follicular proliferation. Simple iodine deficiency and both selenium and iodine deficiency greatly induce the thyr

9、oid follicular proliferation.    Key Wordsrat; selenium deficiency; iodine deficiency; thyroid gland    硒、碘是人体发育所必须的微量元素1。适量碘摄入是维持甲状腺正常形态与功能的重要条件。硒通过硒蛋白参与甲状腺素的代谢及甲状腺的抗氧化过程25。以往的硒、碘缺乏对甲状腺形态结构的影响多以原代的成年动物模型为研究对象6,7。而对长期硒、碘缺乏动物其仔代的甲状腺研究却少有报道。本实验观察了长期低硒、低碘喂养的第3代大鼠不同发育日龄甲状腺形

10、态结构的改变以及增生情况，以探讨低硒、低碘对仔代发育期大鼠甲状腺形态结构的影响。    1 材料与方法    11实验动物分组及样品制备选取本课题组前期成功建立的人工低硒、低碘饲料喂养繁殖的SD大鼠模型仔3代胎鼠(F3E)、4日龄(F3P4)、21日龄(F3P21)、成年(F3A)4个发育时间点的大鼠为研究对象。以健康断乳后封闭群SD大鼠为原代(F0)，每组雌雄各半，随机分为对照组硒(0103)g/g，碘02g/g，低硒(Se-)组硒002g/g，碘02g/g，低碘(I-)组硒(0103)g/g，碘004g/g，低硒、低碘(Se-I-

11、)组硒(001002)g/g，碘004g/g，并分别喂以不同硒、碘水平的人工配制饲料。硒以亚硒酸钠溶液，碘以碘酸钾溶液按上述剂量加入人工配制的固体饲料。大鼠自由进食，饮用去离子纯净水。每代大鼠发育至34月龄时开始交配，母鼠怀孕期、哺乳期饲料水平维持不变，仔鼠由母鼠哺育至21d断奶，连续繁衍至仔4代。在不同发育时间点各组大鼠断头处死，沿气管找到甲状腺，迅速取出置入体积分数10%的中性福尔马林溶液内固定，常规脱水，浸蜡，包埋，并连续切片(厚05m)。    12 苏木精_伊红染色、组织学观察及滤泡计数切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，苏木精染色5min，水洗片刻，盐酸

12、酒精分化数秒，水洗10min，饱和碳酸锂溶液数秒，水洗10min。伊红染液10s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。在成年、21d、4d 3个时间点的每一实验组内选取5个标本，利用Qwin40图像分析系统(Leica公司，德国)每一标本选取5个200倍镜下视野进行滤泡计数，求出平均值。    13免疫组化染色及结果判断切片常规脱蜡至水，体积分数3%的H2O2室温孵育10min。PBS洗5min共3次。微波修复抗原20min，室温冷却30min。PBS洗5min共3次。加入稀释的PCNA单克隆一抗(上海长岛生物公司，中国，编号M_0437)，4冰

13、箱过夜。室温平衡5min，PBS洗3min共3次。滴加二抗，37恒温30min。PBS洗5min共3次。DAB显色，脱水，透明，封固。PCNA阳性反应细胞为细胞核着色，应用IM50图像采集系统(Leica公司，德国)每张切片在400倍镜下随机选取5个视野观察计数阳性表达率无阳性细胞为()，阳性细胞比率25为()， 2550为()， 5075%为()，>75%为()。    14  主要仪器与试剂Reichert_Jung 820石蜡切片机、DMRXA2全能显微镜、Qwin 40图像分析系统、IM50图像采集系统(Leica公司，德国)。CH_2显微

14、镜(Olympus公司，日本)。PCNA单克隆_抗体；HRP标记的两步法抗小鼠、抗兔检测试剂(上海长岛生物公司代理，Antibody Diagnositica公司，美国，编号D_3004)。DAB底物试剂(上海长岛生物公司，中国，编号FL_6001)。    15统计学处理应用SPSS115统计软件分析实验结果，采用单因素方差分析以及卡方检验。       2 结果    21 甲状腺组织学观察不同硒、碘水平喂养的大鼠甲状腺可有不同改变。F3A：成年对照组甲状腺滤泡大小不等，周边滤泡较

15、中央的大，腔内胶质丰富，滤泡上皮细胞呈矮立方状，部分周边滤泡上皮细胞扁平。与对照组比，Se-组镜下形态变化不明显，但部分标本有滤泡坏死纤维化的改变；I-组镜下见滤泡增多，体积小，排列密集，滤泡腔小，腔内胶质稀薄有空泡。滤泡上皮细胞呈单层立方状或柱状。滤泡间有淋巴细胞浸润、聚集。Se-I-组滤泡数量多，排列密集，滤泡腔小，甚至无腔而呈一细胞团，腔内胶质稀薄有空泡。滤泡上皮细胞呈立方或柱状。F3P21：21日龄的大鼠各组甲状腺镜下形态与成年组无太大差别。对照组与Se-组相似：滤泡大小不一，周边大，中间小，胶质丰富，滤泡上皮细胞呈矮立方或扁平状。Se-组无滤泡坏死和纤维化。I-组出现小滤泡增生改变，

16、滤泡体积小，数量多，排列紧密，滤泡腔小，腔内胶质稀薄，滤泡上皮细胞呈立方或柱状。Se-I-组同样出现明显的小滤泡增生改变，滤泡小，数量多，胶质稀薄，滤泡腔小甚至无腔，呈一细胞团。滤泡上皮细胞呈立方至高柱状。F3P4：4日龄大鼠甲状腺总体呈幼稚状态，滤泡体积相对成年与21日龄小，对照组甲状腺大滤泡少见，胶质丰富，滤泡上皮细胞多呈矮立方状。Se-组与对照组相似。I-组与Se-I-组甲状腺滤泡同样呈增生状态，数量增多，体积缩小，排列紧密，滤泡腔小，有的还未形成滤泡而仅成一细胞团。F3E：胎鼠对照组甲状腺与其他日龄对照组相比呈明显幼稚状态，细胞密集，典型的滤泡少见，多数为腔小或未成腔的细胞团，已成腔的滤泡内胶质稀薄。滤泡细胞多呈立方状，滤泡间质丰富。I-组与对照组比细胞密度增大，典型的滤泡少见，细胞团增多，排列紧密。Se-组和Se-I-组胎鼠甲状腺形成的典型滤泡多于对照组与I-组，但仍然是小腔滤泡