第十二章微生物学新技术在环境工程中的应用

1、第十二章 微生物学新技术在环境工程中的应用 微生物学新技术微生物学新技术 包括包括：遗传诱变育种、基因工程、：遗传诱变育种、基因工程、发酵工程、酶工程、微生物制剂、发酵工程、酶工程、微生物制剂、生物表面活性剂等。生物表面活性剂等。12-1 固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用 一、酶制剂剂型一、酶制剂剂型 1 1、干燥粗酶制剂、干燥粗酶制剂 将用麸曲或深层发酵的培养液将用麸曲或深层发酵的培养液除菌除菌( (或不除菌或不除菌) )后，与后，与淀粉等惰性填料淀粉等惰性填料混合、干燥混合、干燥制成制成粗酶粗酶。2 2、稀液体酶制剂、稀液体酶制剂 将培养液过滤除将培养液过滤除去去菌体等菌体等杂质杂

2、质后，直接后，直接加稳定剂加稳定剂( (甘油、甘油、乙醇、氯化钠等的复合物乙醇、氯化钠等的复合物) )和防腐剂和防腐剂作为作为商品商品出售。出售。 3 3、浓液体酶制剂、浓液体酶制剂 将培养液除将培养液除去去菌体等菌体等杂质杂质、浓缩浓缩后再后再加稳定剂和防腐加稳定剂和防腐剂剂制成制成商品商品。4 4、干燥粉状酶制剂、干燥粉状酶制剂我国多数生产此种酶制剂，其制备工艺为：我国多数生产此种酶制剂，其制备工艺为：过滤培养液去菌体过滤培养液去菌体浓缩浓缩喷雾干燥喷雾干燥研磨研磨加稳定加稳定剂、惰性填料剂、惰性填料成商品成商品过滤培养液去菌体过滤培养液去菌体硫酸铵盐析或乙醇沉淀硫酸铵盐析或乙醇沉淀干燥干

3、燥研磨研磨加稳定剂、惰性填料加稳定剂、惰性填料成商品成商品5 5、结晶酶、结晶酶6 6、固定化酶固定化酶 将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可较长时间使用。可较长时间使用。 二、酶的提取二、酶的提取 1 1、预处理、预处理不同的酶有不同的预处理方法：不同的酶有不同的预处理方法：胞外酶存在培养液中，只需将菌体过滤或离心除去，所胞外酶存在培养液中，只需将菌体过滤或离心除去，所得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲，用水或缓冲得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲，用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去菌体及杂物后所得清液即为粗酶液浸泡，再离心

4、或过滤去菌体及杂物后所得清液即为粗酶液。粗酶液再经提纯即为酶精制品。液。粗酶液再经提纯即为酶精制品。对胞内酶则要破碎细胞壁和质膜，制成无细胞提取液再对胞内酶则要破碎细胞壁和质膜，制成无细胞提取液再提纯。提纯。 细胞破碎方法有：干燥法细胞破碎方法有：干燥法( (空气干燥、真空冷冻干燥、溶空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥剂脱水干燥) )、机械法、机械法( (研磨法、机械捣碎研磨法、机械捣碎) )、超声波破碎、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。 2 2、酶的提取、酶的提取 (1)(1)水溶液提取法：用稀的盐溶液、缓冲液或水提水溶液提取法：用稀的盐溶液、缓冲液

5、或水提取。取。 (2)(2) 表面活性剂提取法表面活性剂提取法 表面活性剂有：天然的胆酸盐、磷脂，合成的十表面活性剂有：天然的胆酸盐、磷脂，合成的十二烷基硫二烷基硫( (磺磺) )酸钠酸钠(SDS,(SDS,阴离子型阴离子型) )、二乙氨基十六烷、二乙氨基十六烷基溴基溴( (阳离子型阳离子型) )、非离子型的有吐温、非离子型的有吐温(Tween)(Tween)及三通及三通X(triton-X)X(triton-X)。 (3) (3) 丁醇提取法丁醇提取法 三、酶的纯化三、酶的纯化 1 1、浓缩、浓缩 2 2、去杂质、去杂质3 3、纯化、纯化4 4、结晶、结晶pHpH沉淀法、利用蛋白质热变性的温

6、度差异、蛋白沉淀剂法。沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异、蛋白沉淀剂法。 盐析法；有机溶剂沉淀法；层析法：吸附层析法、离子盐析法；有机溶剂沉淀法；层析法：吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析交换层析法、分子筛过滤层析( (凝胶过滤层析凝胶过滤层析) )法、等电点法、等电点沉淀法。沉淀法。 当酶达到一定纯度后，在适当的温度、当酶达到一定纯度后，在适当的温度、pHpH条件下，逐渐条件下，逐渐加入硫酸铵溶液中，酶可慢慢析出结晶，也可加入某些有加入硫酸铵溶液中，酶可慢慢析出结晶，也可加入某些有机溶剂析出结晶。机溶剂析出结晶。 葡萄糖凝胶分子筛浓缩法、聚乙二醇葡萄糖凝胶分子筛浓缩法、聚乙二醇(PE

7、G)(PEG)浓缩法、浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离。超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离。四、固定化酶和固定化微生物的固定化方法四、固定化酶和固定化微生物的固定化方法 ( (一一) ) 固定化酶与固定化微生物固定化酶与固定化微生物 1 1、固定化酶、固定化酶 从筛选、培育获得的优良菌种体中提取活性极高的酶，再用包埋法从筛选、培育获得的优良菌种体中提取活性极高的酶，再用包埋法( (或或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统) )等方法将酶固定在载体上，制等方法将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即。成不溶于水的固态酶，即。2 2、

8、固定化微生物、固定化微生物 利用与固定化酶相同的方法将酶活力强的微生物体固定在载体上，即利用与固定化酶相同的方法将酶活力强的微生物体固定在载体上，即成。分死细胞固定化和生长细胞固定化成。分死细胞固定化和生长细胞固定化2 2种。种。 微生物本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保微生物本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。持其原有活性，甚至可提高活性。3 3、固定化酶与固定化微生物的特性、固定化酶与固定化微生物的特性 固定化酶与固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降固定化酶与固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降

9、解有机物能力强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷。解有机物能力强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷。 ( (二二) ) 固定化酶与固定化微生物的固定方法固定化酶与固定化微生物的固定方法 固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束酶反应系统。酶反应系统。 1 1、载体结合法、载体结合法 以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤

10、维素等。2 2、交联法、交联法 将酶与有两个或两个以上官能团的试剂反应形成共价将酶与有两个或两个以上官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。甲撑二异氰酸酯。 3 3、包埋法、包埋法 将酶包埋在凝胶微小格子将酶包埋在凝胶微小格子( (格子型格子型) )中，或将酶包裹在中，或将酶包裹在半透性的聚合物膜内半透性的聚合物膜内( (微型胶囊型微型胶囊型) )的固定方法。格子型的的固定方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺包埋材料：聚丙烯酰胺(PACAM)(PACAM)凝胶、聚乙烯醇凝胶、聚乙烯醇(PVA)(PVA

11、)、琼、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。硝酸纤维素。4 4、逆胶束酶反应系统、逆胶束酶反应系统 表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成。中，组成。 五、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用五、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用 1 1、污染物

12、处理、污染物处理 应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污水处理系统。日本将水处理系统。日本将淀粉酶固定后用于处理淀粉废水和造纸废淀粉酶固定后用于处理淀粉废水和造纸废水，效果较好。美国有人将多酚氧化酶固定后用于含酚废水处理，水，效果较好。美国有人将多酚氧化酶固定后用于含酚废水处理，效果显著。德国将效果显著。德国将9 9种降解对硫磷农药的酶固定到多孔玻璃珠及硅胶种降解对硫磷农药的酶固定到多孔玻璃珠及硅胶珠上，再制成酶柱处理对硫磷废水，获得珠上，再制成酶柱处理对硫磷废水，获得9595以上的去除效果，连以上的去除效果，连续运行续

13、运行2 2个多月酶活性基本不变。有人将白腐菌固定在海藻酸钙上对个多月酶活性基本不变。有人将白腐菌固定在海藻酸钙上对造纸黑液进行处理，脱色率高达造纸黑液进行处理，脱色率高达8080以上。以上。2 2、环境监测、环境监测 根据固定化酶用于化学分析方面的相同原理，固定化酶也可用于根据固定化酶用于化学分析方面的相同原理，固定化酶也可用于测定有毒物质的含量，对环境进行监测。如固定化多酚氧化酶可用测定有毒物质的含量，对环境进行监测。如固定化多酚氧化酶可用来测定水中的酚类物质。固定化酶可用于检测有机磷、有机氯农药、来测定水中的酚类物质。固定化酶可用于检测有机磷、有机氯农药、过氯酸盐、氰化物和尿素等。过氯酸盐

14、、氰化物和尿素等。 12-2微生物细胞外多聚物的开发与应用 微生物的微生物的胞外多聚物胞外多聚物(ECP)(ECP)是微生物在一定是微生物在一定环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的多聚化合物。微生物细胞壁外的多聚化合物。 这些多聚物经分析得知其成分为脂、脂肽、这些多聚物经分析得知其成分为脂、脂肽、多糖脂、中性类脂衍生物等。多糖脂、中性类脂衍生物等。包括荚膜、粘液层及其它表面物质。包括荚膜、粘液层及其它表面物质。 微生物细胞外物质可作微生物细胞外物质可作表面活性剂、絮凝剂或助凝表面活性剂、絮凝剂或助凝剂、沉淀剂。剂、沉淀剂。 一、生物表

15、面活性剂一、生物表面活性剂 1 1、表面活性剂是由亲水基和疏水基两部分组、表面活性剂是由亲水基和疏水基两部分组成的，具有成的，具有影响影响不相容界面不相容界面特性特性的物质。的物质。2 2、生物表面活性剂、生物表面活性剂(biosurfactant)(biosurfactant) 是生物在一定生长条件下，在其代谢过是生物在一定生长条件下，在其代谢过程中分泌产生的一些具有一定程中分泌产生的一些具有一定表面表面/ /界面界面活性活性的代谢产物。的代谢产物。 3 3、分类、分类 生物表面活性剂按用途可广义地分生物表面活性剂按用途可广义地分为为生物表面活性剂生物表面活性剂和和生物乳化剂生物乳化剂(bi

16、oemulsifier)(bioemulsifier)。 前者是一些前者是一些低分子量低分子量的小分子，能的小分子，能显显著改变著改变表面表面/ /界面张力。界面张力。 后者是一些后者是一些生物大分子生物大分子，并不能显著降并不能显著降低低表面表面/ /界面张力，但对油界面张力，但对油/ /水界面表现出水界面表现出很强的亲和力。因而可使乳状液得以稳定。很强的亲和力。因而可使乳状液得以稳定。 (1)(1)利用生物表面活性剂对油类的乳化作用，可将生物利用生物表面活性剂对油类的乳化作用，可将生物表面活性剂用于表面活性剂用于海上原油泄漏海上原油泄漏的生物降解与海岸石油的生物降解与海岸石油污染的生物补救

17、。污染的生物补救。4 4、生物表面活性剂在环境工程中的应用、生物表面活性剂在环境工程中的应用(2)(2)生物表面活性剂对有毒有机化合物具有生物表面活性剂对有毒有机化合物具有增溶作用增溶作用，可用于土壤，可用于土壤环境污染的生物修复。环境污染的生物修复。 BacilluBacillus s菌产生的一种生物表面活性剂能稳定地乳化杀虫剂肟菌产生的一种生物表面活性剂能稳定地乳化杀虫剂肟( w )( w ) 硫 磷 及 其 他 不 能 与 水 混 溶 的 液 态 有 机 磷 杀 虫 剂 。硫 磷 及 其 他 不 能 与 水 混 溶 的 液 态 有 机 磷 杀 虫 剂 。Pseudomonas cepac

18、iaPseudomonas cepacia能产生一种降解除草剂能产生一种降解除草剂2,4,5,-2,4,5,-三氯苯氧基三氯苯氧基乙酸的生物表面活性剂。乙酸的生物表面活性剂。(3)(3)另外，另外，MulliganMulligan和和coopercooper认为生物表面活性剂能用于认为生物表面活性剂能用于泥浆脱泥浆脱水水。在采矿业和造纸业中，采用某些生物表面活性剂可稳定矿物。在采矿业和造纸业中，采用某些生物表面活性剂可稳定矿物的水悬浮液，以避免矿物的絮凝。国内有报道采用表面活性剂回的水悬浮液，以避免矿物的絮凝。国内有报道采用表面活性剂回收炼油厂废白土中的蜡和油，回收率可达收炼油厂废白土中的蜡和

19、油，回收率可达9393和和9595。 生物表面活性剂还可用于石油及能源工业、医疗领域、食品工生物表面活性剂还可用于石油及能源工业、医疗领域、食品工业、化妆品工业等。业、化妆品工业等。二、微生物絮凝剂二、微生物絮凝剂 1 1、微生物絮凝剂：是利用生物技术，从微、微生物絮凝剂：是利用生物技术，从微生物体内或分泌物中分离提取的一种安全、生物体内或分泌物中分离提取的一种安全、高效且能自然降解的新型水处理剂。高效且能自然降解的新型水处理剂。 它是由一类微生物产生的，可使液体中它是由一类微生物产生的，可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒、固体细胞及胶体不易沉降的固体悬浮颗粒、固体细胞及胶体颗粒等凝聚、沉淀的特

20、殊高分子代谢产物颗粒等凝聚、沉淀的特殊高分子代谢产物( (次生代谢产物次生代谢产物) )。 2 2、微生物絮凝剂的主要成分是高分子、微生物絮凝剂的主要成分是高分子有机物，包括糖蛋白、粘多糖、纤维素有机物，包括糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等。其分子量多在和核酸等。其分子量多在10105 5以上。以上。 3 3、微生物絮凝剂的独特性质和特点、微生物絮凝剂的独特性质和特点易于固液分离，沉淀物生成量少；易于固液分离，沉淀物生成量少；无毒无害、安全性高，易被微生物降解；无毒无害、安全性高，易被微生物降解；具有脱色和除浊性能；具有脱色和除浊性能；无二次污染；无二次污染；适用范围广；适用范围广；有的生物絮凝

21、剂具有热稳定性强、用量小、有的生物絮凝剂具有热稳定性强、用量小、不受不受pHpH条件影响等。条件影响等。 4 4、微生物絮凝剂的应用、微生物絮凝剂的应用 (1)(1)废水悬浮物的处理废水悬浮物的处理 (2)(2)废水脱色处理废水脱色处理 (3)(3)乳浊液的油水分离乳浊液的油水分离 (4)(4)污泥处理污泥处理 (5)(5)畜产废水处理畜产废水处理 (6) (6) 微生物絮凝剂在其它领域的应用微生物絮凝剂在其它领域的应用 三、生物吸附剂三、生物吸附剂 生物吸附是微生物菌体对重金属的吸附作用，包生物吸附是微生物菌体对重金属的吸附作用，包括细胞的不同部位对重金属的络合、螯合、离子交换、括细胞的不同部位对重金属的络合、螯合、离子交换、转化、吸收和无机微沉淀等。转化、吸收和无机微沉淀等。 生物吸附剂主要分生物吸附剂主要分3 3类，即细菌、真菌和藻类。另类，即细菌、真菌和藻类。另外，壳聚糖也是一类重要的生物吸附剂。外，壳聚糖也是一类重要的生物吸附剂。 能够吸附重金属及其它污染物质的生物来源材料能够吸附重金属及其它污染物质的生物来源材料称生物吸附剂。称生物吸附剂。12-3 优势菌种与生物制剂的开发与