兔未成熟心肌增龄性变化及成熟时限的研究

1、    兔未成熟心肌增龄性变化及成熟时限的研究        【摘要】目的研究兔未成熟心肌的成熟时限及其特性。方法分别以1、3、5、7、16、24周龄正常兔心肌为对象，每组10只，从形态结构、钙代谢、能量代谢、氧自由基代谢、内分泌功能及其基因表达等方面进行研究。结果正常兔未成熟心肌结构、功能有其特点，随周龄增长主要变化多发生在37周龄，至7周龄时绝大多数研究指标趋于成熟，各指标成熟时间先后不一，心肌基本成熟时间早于性成熟期。结论正常未成熟心肌结构、功能约在7周龄左右基本接近成

2、熟，早于性成熟期。【关键词】未成熟心肌；成熟心肌 The age-related changes and mature demarcation study of rabbit immature myocardiumGENG Qing,GAO Shangzhi.（Department of Thoracic and Cardiac Surgery, Shenzhen Central Hospital, Shenzhen 518036,China）【Abstract】ObjectiveTo study mature demarcation of immature myocardium and it

3、s characteristics.MethodsThe myocardium in 6 groups of normal rabbits with different ages of 1,3,5,7,16 or 24 weeks (n=10 rabbits in each group) were studied in morphoultrastructure,calcium metabolism,energy metabolism,oxygen free radical metabolism,endocrine function and gene expression.ResultsThe

4、immature myocardium of the rabbits has its own structural,functional characteristics.As age was increased,most changes occurred at 3 to 7 weeks,and nearly tended to mature levels at about 7 weeks old.The mature demarcation of each index was inconsistent.The essential mature time of myocardium was ea

5、rlier than viripotent period.ConclusionThe structure and function of immature rabbit myocardium have their own characteristics and nearly tended to the mature levels at about 7 weeks old,which was earlier than viripotent period.【Key words】Immature myocardium;Mature myocardium    

6、 我们通过动物实验，观察兔出生后的未成熟心肌增龄性变化，确定未成熟心肌的成熟时限，并研究其特性，现将结果报道如下。 材料与方法1.实验对象：以健康中国大耳白兔为研究对象，按周龄分为6组：1、3、5、7、16、24周各为1组，每组各10只兔，雌雄不拘。2.实验方法：腹腔内注射戊巴比妥钠(50 mg/kg体重)后，迅速取出心脏，取心房肌及数块心室肌标本，分别测定心肌内分泌功能及形态结构、物质代谢、基因表达。3.观察内容及监测指标：(1)形态结构：光镜、电镜观察后用MPIAS-1000型多媒体像分析系统进行如下指标的立体计量学测量：心肌细胞直径、肌节长度、浆核比、肌原纤维体密度(Vv)、线粒体体密度

7、(Vv)、面数密度(Na)、比表面()、心肌间质面积百分比、心肌毛细血管密度。(2)物质代谢：测定心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；心肌Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量；应用差速离心法提取线粒体、肌浆网粗制膜，测定其Ca2+-ATP酶活性及其Ca2+含量；心肌乳酸脱氢酶(LDH)、激酸激酶(CK)活性、-羟丁酸脱氢酶/乳酸脱氢酶(-HBDH/LDH)比值及乳酸(LA)含量；荧光素酶法测心肌ATP含量，Winifred法测心肌线粒体合成ATP能力及其CK活性；对氨基水杨酸(PAS)法显示心肌糖原并用像分析法测定其平均吸光度表示相对含量。(3)放射免疫法测定心肌血管紧张素

8、(Ang)、心钠素(ANP)含量。(4)心肌细胞增殖能力：Feulgen法显示心肌细胞DNA，用像分析法进行DNA倍性分析；心肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA及原癌基因c-myc mRNA原位杂交：PCNA免疫组织化学、bFGF、c-myc原位杂交检测试剂盒为博士德生物工程公司产品。光镜观察后用像分析法测定其平均吸光度表示相对含量。4.统计学处理：采用t检验、相关回归分析。结果1.超微结构：(1)与周龄呈正相关：心肌细胞直径(r=0.689 6,P0.01);心肌细胞浆核比(r=0.735 0,P0.01)；心肌细胞肌原纤维Vv(r=0.

9、682 5,P0.01)；心肌细胞线粒体Vv、Na(r分别为0.772 9和0.519 6，P均0.05)。(2)与周龄呈负相关：心肌毛细血管密度(r=-0.281 9,P0.05)。(3)与周龄无关：心肌细胞肌节长度(r=-0.184 2,P0.05)；心肌细胞线粒体(r=0.088 7,P0.05);心肌间质面积百分比(r=-0.243 9,P0.05)。2.物质代谢：(1)心肌SOD活性与周龄呈负相关(r=-0.752 2,P0.01)；而MDA含量则与周龄呈正相关(r=0.736 6,P0.01)；(2)心肌Na+、K+含量与周龄无关(r分别为-0.168 1和-0.178 1,P0.

10、05)；Ca2+含量与周龄呈正相关(r=-0.699 8,P0.01)；Mg2+含量与周龄呈负相关(r=-0.488 8,P0.05)；(3)心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性及Ca2+含量与周龄呈正相关(r分别为0.640 2和0.683 5,P0.01)，线粒体Ca2+-ATPase活性及Ca2+含量与周龄呈负相关(r分别为-0.776 1和-0.674 4,P0.01)；(4)心肌LA、ATP及糖原含量与周龄呈负相关(r分别为-0.774 6、-0.611 0和-0.721 4，P0.01)；心肌LDH、CK活性及-HBDH/LDH比值与周龄呈正相关(r分别为0.597 9、0.863

11、 3和0.669 7，P0.05)；心肌线粒体合成ATP能力及CK活性均与周龄呈正相关(r分别为0.794 5和0.741 9,P0.01)。3.心脏内分泌功能：心肌Ang、ANP含量与周龄呈负相关(r分别为-0.521 3和-0.408 3,P0.05)。4.心肌细胞增殖能力：(1)心肌细胞DNA倍性分布：心肌细胞二倍体与周龄呈负相关(r=-0.783 4,P0.01)，而四倍体与周龄呈正相关(r=-0.688 9,P0.01)，5周龄开始出现少量八倍体。(2)心肌细胞PCNA蛋白定位于心肌细胞核，呈棕黄色细颗粒。其平均吸光度均随周龄增长显著降低，3周龄以后各组无PCNA表达。(3)心肌细胞

12、bFGF mRNA定位于胞浆，呈棕黄色颗粒。出生至5周龄心肌细胞bFGF mRNA表达随周龄增长其平均吸光度显著减少，在以后各组心肌细胞无阳性表达，但在间质中偶有弱阳性表达。(4)心肌细胞c-myc mRNA定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状分布。随周龄增长，c-myc mRNA阳性表达平均吸光度显著下降，3周龄以后各组无阳性表达。讨论随周龄增长，正常兔心肌结构、功能逐渐发育成熟。未成熟心肌作为心肌发育学上一个独特的阶段，其结构、功能有其特点。未成熟心肌细胞小，胞内肌原纤维含量少，分布较为疏松，非收缩性成分所占比重大，线粒体少、体积小、嵴发育不全，肌浆网稀疏，T管密度低，质膜面积与细胞容积比值高。未成

13、熟心肌收缩力弱，心肌顺应性差，功能储备低，几乎为最大变肌力状态。未成熟心肌细胞钙调节系统尚未发育成熟，膜系统发育不完善，钙泵活性低，Ca2+向肌浆网内主动转运速度慢，胞内Ca2+储备少，其兴奋收缩偶联主要依赖细胞外Ca2+的参与1。未成熟心肌糖原颗粒丰富，糖原分解和无氧酵解能力强，其能量主要来源于葡萄糖或糖原的有氧分解和无氧酵解，未成熟心肌苹果酸/天门冬氨酸穿梭能力强2。未成熟心肌SOD活性高，其抗自由基损伤、抗氧化能力强。我们的研究结果表明，正常兔未成熟心肌结构、功能约在7周龄左右基本趋于成熟。各观察指标成熟时限先后不一，其中结构成熟稍早于功能成熟。心肌基本成熟时间早于性成熟期。鉴于未成熟心肌在结构、功能的特点，未成熟心肌保护有其特殊性，其心肌停搏液应采用适宜的温度、Ca2+浓度、能量底物以及灌注次数、压力以增强其心肌保护效果2，3。基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J074)作者单位：耿庆（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院胸心外科现在深圳市中心