革兰氏染色法

1、实验 革兰氏染色法实验目的1.1 实验器材 菌种金黄色葡萄球16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 溶液和试剂香柏油，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等。 仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，接种环，试管架，滴管等。2 实验现象与分析2.1 实验步骤制片取生长活跃期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。2.1.2初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min之后倾去染液，水洗至流出水无色。媒染先用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘

2、液，水洗至流出无色。脱色将载玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用95%乙醇脱色(20-30s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。复染将玻片上残留水用吸水纸洗去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水，晾干。镜检.1观察前的准备(1)安置显微镜.(2)将聚光器调到最高位置,调节光源,使视野内光线均与,亮度适宜.(3)根据使用者的个人情况,调节双筒显微镜的目镜.(4)调节聚光器的数值孔径.2显微观察在低倍镜下找到要观察的样品区域后,用粗调节器将镜筒升高,将油镜转到工作位置,然后在待观察的样品区域滴加香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心的降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的

3、数值孔径以及视野的照明强度后，用粗调节器将镜筒镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰聚焦为止。.3显微镜用后的处理 (1)上升镜筒，取下载玻片。(2)用擦镜纸擦去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。(3)用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。(4)将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭。2.2 实验结果 一 试验图片图一 枯草芽孢杆菌（G+） 图二 大肠杆菌（G） 图三 金黄葡萄球菌（G+） 二 结果记录表菌名菌体颜色细菌形态结果枯草芽孢杆菌蓝紫色杆状，表面有光泽G+大肠杆菌红色杆状，粗壮G金黄色葡萄球

4、菌蓝紫色球状G+3 实验分析（1）本实验成功的关键选用活跃生长期细菌染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性；涂片不宜过厚，以免脱色不彻底造成假阳性；脱色是革兰氏染色的关键，脱色不全造成假阳性，脱色过度造成假阴性。（2）为什么用老龄细菌进行染色会造成假阴性？若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使细胞壁的成分和通透性均发生了改变，使结晶紫染液容易在脱色中被洗脱下来，易出现假阴性。（3）革兰氏染色法中那个步骤可以省略？复染这一步可省略，因为脱色后G+是紫色的而G-无色，已经可以区分。但是如果不复染，镜检时看那不清G-的细胞形态。媒染这一步也可以省略，因为媒染剂的作用机理是形成碘-结晶紫复合物

5、，从而增强染料与细菌细胞壁的结合能力，脱色时不易脱去。当菌体本身能过与结晶紫结合紧密时，可以省去媒染这一步。（4）为甚么感染肺炎的肺部组织经革兰氏染色后未被染上蓝紫色？肺部组织细胞无细胞壁,细胞膜的主要成分是脂质，与结晶紫结合不紧密，容易脱色,因而不呈现紫蓝色.4 实验小结在油镜的使用过程中，油镜浸在香柏油中与标本相接，切不可将高倍镜转动过加镜油的区域，否则菌体可能附着在镜头上，污染涂片，造成假象。涂片时应注意刮取少量菌体，涂抹均匀，使细菌悬液的浓度偏低。否则细菌密集，草酸铵结晶紫与细菌结合致密，很难用酒精脱去，可能造成局部假阳性。在革兰氏染色过程中，控制脱色时间至关重要。脱色不全造成假阳性，脱色过度造成假阴性。此次实验过程中，由于脱色时间过长，金黄色葡萄球菌在显微镜下呈现紫色和