木质素降解菌的筛选及混合菌发酵降解秸秆的研究_图文

1、中国生物工程杂志 Ch i n a B iotechnology , 2008, 28(2:6670木质素降解菌的筛选及混合菌发酵降解秸秆的研究*黄 茜1, 2黄凤洪2*江木兰2 万楚筠2 刘 睿2(1华中农业大学食品科技学院 武汉 430070 2中国农科院油料作物研究所 武汉 430062摘要 农作物秸秆是农业生产的副产品, 也是一项重要的生物资源。其成分结构的特殊性所导致的难降解问题, 一直是转化利用秸秆的难题。利用混合菌将秸秆纤维素转化为蛋白质、乙醇、乙酸、乳酸等研究是目前热点。通过马铃薯琼脂平板培养、马铃薯液体摇瓶培养和稻草秸秆固态发酵, 从6株常见的食用白腐菌中筛选出了生长优势较强

2、、产漆酶酶活高的平菇HF 。为了让秸秆得到更好的降解和利用, 采用平菇和康氏木霉二步混合发酵法; 通过不同的组合方式, 发现H 6-T 10组合得出的降解效果最好, 其木质素降解率达到44. 77%, 纤维素降解率达到41. 48%。关键词 秸秆降解 混合发酵 白腐真菌 木质素 纤维素中图分类号 Q819收稿日期:2007-11-21 修回日期:2007-12-19*武汉市科技攻关资助项目(20062002063 *通讯作者, 电子信箱:huangf h oil crops . cn农作物秸秆作为一种可再生资源, 在我国具有分布广、数量大、种类多、价格低廉的特点。如何充分利用这些资源而又使环境

3、不受污染, 是现代农业面临的难题1。农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分组成, 由于纤维素特别是木质素难以被分解, 影响其利用推广。近几十年来, 国内外科研人员虽然研究了一些物理、化学的秸秆利用方法, 但都存在着利用不充分、成本高等问题24。实践表明, 秸秆的生物法利用是最佳途径, 此法具有降解率高, 安全环保, 成本低等优点。自然界中存在许多微生物可以腐蚀和分解秸秆、树叶及树木等高纤维物质, 这些微生物包括细菌、霉菌、酵母菌及食用菌等5。因为秸秆中纤维素含量最高, 所以人们一开始是利用纤维素降解菌 主要是木霉来进行纤维素的降解。但是在对秸秆结构进行研究以后, 人们发现木质素与半纤

4、维素以共价键形式结合, 将纤维素分子包埋在其中, 形成一种天然屏障, 使纤维素酶等不易与纤维素分子接触, 而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性, 导致了秸秆的难降解性6。因此要彻底降解纤维素, 首先必须解决木质素的降解问题, 而对木质素能进行最有效降解的微生物是白腐真菌(white -rot f ungi7。白腐真菌依赖一系列酶催化反应实现对难降解有机物的转化, 这一过程尤为复杂, 其中的关键酶系为木质素降解酶系。木质素降解酶系主要包括三部份:木质素过氧化物酶(li gni n peroxidase , L i P 、锰过氧化物酶(manganese -de pe ndent peroxida

5、se , M nP 以及漆酶(laccase8。对6株木质素降解菌白腐真菌进行了筛选, 并探索了其与纤维素降解菌康氏木霉(T richo der ma koningii 协同发酵降解秸秆的组合方式; 通过对这2种真菌混合发酵降解秸秆的纤维素、木质素和半纤维素的研究, 以期为秸秆的综合利用提供理论与数据参考。1 材料与方法1. 1 试验材料康氏木霉(Trichoder ma koningii 3. 2774, 由中科院微生物研究所提供; 6株白腐真菌:平菇(Pteurorus ostreatusH F 、平菇S N 、黑木耳(Auriculariaauricular 、双孢蘑菇(Agaricus

6、bis porus 、香菇(Lentinula edodes 和榆黄磨(Pleurotus citrino p ileatus , 均由本实验室提供。 稻草秸杆, 来自武汉市蔡甸区, 经测定其纤维素、半纤维素以及木质素含量分别为:34. 62%、21. 39%和9. %。2008, 28(2黄 茜等:木质素降解菌的筛选及混合菌发酵降解秸秆的研究1. 2 培养基马铃薯琼脂培养基(PDA :马铃薯(质量分数, 以下同 20%, 蔗糖2%, 琼脂2%。马铃薯液体培养基:土豆20%,蔗糖2%, 灭菌后分装入250m l 三角瓶中, 装液量为50m l 。固态发酵培养基:稻草秸秆(40目 5. 0g ,

7、 合成培养液912m l 。1. 3 试验设计 1. 3. 1 白腐菌的筛选 通过6种白腐真菌的菌丝生长速度快慢、生物量大小和产酶酶活高低3个方面的比较, 筛选出生长优势强、产木质素降解酶酶活高的优势菌株。 PDA 平板培养:将白腐真菌点接到P DA 平板中心, 每24h 观察菌丝的生长状况, 并测量其菌落直径。摇瓶液体培养:用打孔器取直径为8mm 的白腐菌菌丝琼脂块3块, 接种到土豆液体摇瓶中, 28e , 150r/min , 培养21天。每3天取一次菌液, 过滤, 滤渣于100e 烘干后称重, 得液体培养的生物量; 滤液(粗酶液 用来测定漆酶酶活。秸秆固态发酵培养:将经5天摇瓶培养的种子

8、液, 以10%的接种量接种到固态发酵基上。28e , 静置培养20天。终止发酵后, 取发酵物5. 0g , 用50m l p H =4. 8的醋酸-醋酸钠缓冲液浸提3h , 过滤, 滤液(粗酶液 用来测漆酶酶活。1. 3. 2 秸秆降解菌的搭配及混合发酵 (1 菌株兼容性试验将由上组试验筛选出的白腐真菌与康氏木霉点接入同一PDA 平板上, 28e 静置培养5天, 观察其生长情况, 比较同一平板上两菌种的生长优势, 以便进行下一步混合发酵试验。(2 秸杆降解菌的混合发酵试验基于上步菌株兼容性试验的结果, 在固态发酵基中, 先接种生长优势较弱的菌株(白腐真菌 , 在其分别生长3, 6, 9, 12

9、天后, 再接种生长旺盛的菌株(康氏木霉 , 其培养时间分别是6, 8, 10天。具体组合如表1所示。发酵完后, 测定发酵物的纤维素、木质素含量。表1 平菇HF 和康氏木霉的组合发酵方式Tab le 1 The co mb inati on m ode of P teurorus ostrea t u sH F and Trichoder m a kon i ngii康氏木霉培养天数/d平菇HF 培养天数/d369126H 3-T6H6-T6H 9-T6H 12-T68H 3-T8H6-T8H 9-T8H 12-T810H 3-T10H 6-T10H9-T10H 12-T10Note :H re

10、presen ts P te uroru s ostre a t u s HF , and T represents T ric hod er ma koning ii . TheH 3-T6comb i nati on group m eans that after cu lti vati on of P te u rorus ost re a t u s H F for 3days , t he soli d s ubs trat e w as i nocu l ate by T richoder m a kon i ng ii . The m i xed fer m en tati on

11、 ti m e w as 6days . The other group are si m ilar1. 4 测定方法1. 4. 1 漆酶(laccase 酶活测定10取粗酶液0. 1m , l加入HA c -N a A c (p H4. 5 缓冲液2. 5m , l 混匀, 加入1mmol /L2, 2c -连氮基-双(3-乙基苯丙噻唑啉-6磺酸 (ABTS 0. 4m , l 反应在25e 下进行, 放置30s , 每15s 读取一次吸光值, 测定3m in 内反应液在420nm 处OD 值的增加。一个酶活力单位(U 定义为在25e , p H5. 0条件下1m l 酶液每分钟氧化底物AB

12、TS 引起吸光值的增加量。1. 4. 2 木质素、纤维素含量的测定 参照王玉万系统分析法11。2 结果与讨论2. 1 白腐菌的筛选21111 平板试验 6株白腐菌均为白色气生菌丝, 且生长状况良好。从图1中可以看到, 其中平菇SN 、平菇HF 以及双孢蘑菇生长较旺盛, 在8天以内白色菌丝都长满了平板, 说明它们都有较强的生长优势。图1 各菌株菌丝生长曲线图F i g . 1 The m yce lia grow th curve of each fungus21112 液体摇瓶培养 在土豆液体摇瓶培养过程中, 这6株白腐菌形成多个白色光滑的菌丝球。由图2所示, 在21天土豆液体培养过程中, 各

13、菌株生物量的变化曲线基本一致, 即开始随天数的增加, 其生物量逐渐增加; 在一定天数后, 其生物量增加变缓, 有些菌株生物量开始减少, 出现这种情况的原因是随着天数的增加, 液体培养基的营养成分消耗殆尽, 或是菌株出现了自溶现象等。另外可以看到, 平菇S N 、平菇HF 、榆黄蘑相较其它菌株, 液体培养得到的生物量较多。 在整个摇瓶培养期间, 菌株分泌的漆酶酶活变化规律如图3所示。可以看到, 各菌株的变化规律基本一致, 随着生长天数的增加, 漆酶酶活逐渐增加, 在第1215天之间出现酶活高峰, 双孢蘑菇、平菇HF 、平菇67 图2 各菌株液体培养生物量变化Fig . 2 The changes

14、 of b io masses i n li qu i dculture of each fungu s166. 42, 934. 20, 865. 65, 883. 63, 686. 47, 315. 21U /ml 。图3 各菌株液体培养过程中漆酶活性变化Fig . 3 T i m e cour se of the L accase ac ti vitydur i ng the f l u i d cu ltu re21113 固态发酵培养 白腐真菌之所以能对基质中的木质纤维有很好的降解能力, 是因为其能产生降解木质素的酶系; 白腐真菌产酶酶活的高低决定了降解能力的大小, 本试验以检测漆酶

15、酶活的大小为参考, 比较各菌株降解秸秆木质素能力的大小。由图4中可以看出, 6株白腐真菌在秸秆固态发酵中所产漆酶酶活力比液体摇瓶培养所产的酶活低, 其中榆黄蘑、平菇HF 以及平菇SN 所产漆酶酶活较高, 分别为601. 33, 648. 39, 582. 70U /ml 。综上所述, 对比其它5株白腐菌菌株, 平菇HF 在PDA 平板、土豆液体培养基和稻草秸秆基质中菌丝生长速度快, 能在较短时间内布满整个培养基, 生长优势明显; 液态培养的菌体生物量最多; 在土豆液体和稻草秸秆发酵中分泌漆酶能力都较强。因此, 选出平菇HF 图4 各菌株固态发酵过程中漆酶酶活变化过程F ig . 4 T i m

16、 e course of laccase activitydur i ng soli d fer m en tation作下一步的秸秆降解菌混合发酵的试验。2. 2 秸秆降解菌的搭配组合及混合发酵21211 菌株兼容性试验 在同一个P DA 平板上(图5 可以看到, 康氏木霉的绿色菌丝占据了将近整个平板, 而平菇HF 的菌落最大直径约为0. 8c m 。说明康氏木霉生长优势比白腐真菌明显, 前者对后者产生了竞争抑制性作用, 因此将康氏木霉与白腐真菌需进行二步混合发酵, 即先在固态培养基中接入平菇HF , 待其生长一定时间后, 再接入康氏木霉。在实验的下一步就要确定两种菌的接种时间间隔。图5 康

17、氏木霉和平菇HF 兼容性试验平板菌落图F ig . 5 T he f l at col on ies of co mpatib ility test w ith Pteurorus ostreatus HF and Trichoder m a kon i ngii1:W h ite co l ony of P t euroru s ostreatus H F ; 2:G reen col ony of T ri chod e rma koning ii21212 康氏木霉与平菇降解效果比较 由表2中的结果可以看出, 在秸秆发酵基中接种单个菌株培养, 降解效果远不如混合菌发酵降解的好:康氏木霉降

18、解纤维素能力较强, 但对木质素的降解率却很低, 而且因受木质素降解限制的影响, 对秸秆纤维素的降解还是不如混合菌; 平菇HF 除了能产生降解木质素的酶系以外, 也能产生一定量的纤维素酶, 但降解纤维素的能力却混合发酵培养时, 从图6中可以看出, 两种菌株接种的时间间隔以6天为最适宜。间隔3天以下时, 因白腐真菌生长较缓慢, 此时接入康氏木霉会对其产生竞争性抑制, 木质素降解率不高; 间隔9天以上时, 则白腐菌菌丝基本已长满培养料, 此时再接入木霉, 后者生长不良, 纤维素的降解率也不高。从二步发酵的各组处理(表2 来看, 经发酵处理后秸秆木质素含量最低的是H12-T 10组合, 其平菇HF 生

19、长旺盛, 发酵周期长, 木质素得到充分的降解, 但纤维素含量仍较高, 主要是接种间隔过长, 康氏木霉生长受到抑制; 而发酵后秸秆纤维素含量最低的组合是H6-T10, 这一组合的木质素降解率也非常高, 仅次于H12-T 10组合, 因此选取组合H6-T10, 其木质素降解率达到44. 77%,纤维素的降解率为41. 48%。表2 平菇HF 和康氏木霉秸秆固态发酵后秸秆的木质素、纤维素含量的测定T ab l e 2 Th e d eter m i nat i on of lign i n and cell u lose in stra w af ter th e soli d ferm en ta

20、tion of P teuroru s ostreatusH F and Trichoder m a kon i ngii混合培养方式木质素含量/%纤维素含量/%H 3-T67. 2922. 38H 3-T87. 3421. 43H 3-T106. 8820. 52H 6-T65. 6722. 02H 6-T85. 2520. 47H 6-T105. 1220. 26H 9-T65. 2724. 37H 9-T85. 2124. 11H 9-T105. 1023. 45H 12-T65. 5424. 09H 12-T85. 3225. 39H 12-T105. 0924. 72平菇HF(单菌培

21、养20天 5. 4724. 81康氏木霉(单菌培养20天8. 1222. 733 结 论从6支可食用的白腐菌中挑选出生长旺盛、降解木质素能力高的平菇HF , 其菌丝平均生长速度为0. 97c m /d ; 生物量在第18天时可达到最高值0. 4418g ; 液体摇瓶培养所产生的漆酶最高酶活为934. 20U /m, l 秸秆固态发酵所产生的漆酶最高酶活为648. 39U /ml 。 将降解木质素的平菇HF 和降解纤维素的康氏木霉做平板拮抗试验, 发现康氏木霉生长优势较强, 对白 腐菌有竞争性抑制作用。因此, 需将两种菌进行二步图6 各组合方式发酵后秸秆的木质素、纤维素降解率F i g . 6

22、Th e d egradati on rate of li gnin and cellu l oseafter each co mb i n ati on m ode fermen tation混合发酵降解秸秆。由不同的混合发酵方式所产生的降解效果来看, H 6-T10组合最适宜, 降解效果最好, 木质素的降解率为44. 77%,纤维素的降解率为41. 48%。参考文献1黄忠乾、龙章富, 彭卫红, 等. 农作物秸秆资源的综合利用.资源开发与市场, 1999, 15(1:3234H uang Z Q ,Long Z F ,Peng W H,et a. lR esourcesDevel op m

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