单克隆抗体在狂犬病预防治疗中的研究进展

1、分子生物医学单克隆抗体在狂犬病预防治疗中的研究进展张海玉,李 娜(综述,张学梅(审校(大连大学医学院,辽宁大连116622中图分类号:R512.99 文献标识码:A 文章编号:1006-2084(201203-0321-03基金项目:“十一五”国家科技支撑计划(2009BAK61B04摘要:体液免疫是机体对抗病毒感染的自然选择之一,抗狂犬病毒(RV抗体在狂犬病的预防和治疗中都发挥着重要作用。现在,抗RV 抗体已由传统的多克隆免疫球蛋白过渡到各种单克隆抗体(mAb、基因工程抗体,抗RV 糖蛋白mAb 主要应用于RV 接触后预防及治疗中,其辅助狂犬病早期诊断,抗RV 糖蛋白不同表位的mAb 联合应

2、用比多克隆免疫球蛋白更具优越性。目前,抗RV 糖蛋白mAb 在狂犬病治疗中还面临着很多困难,如血脑屏障的生理性阻隔、难以清除寄生在神经元细胞内部的病毒等。现就mAb 在狂犬病预防治疗中的研究进展予以综述。关键词:单克隆抗体;狂犬病;狂犬病毒;预防治疗St udy of M o noclo nal Antibo dy in the Pro phylaxis and Tre atment of Rabies ZH ANG H ai-yu,L I Na,ZHANG Xue-m ei.(Medical C ollege of Dalian Univer sity,Dalian 116622,China

3、Abst rac t:Humoral immunity is the natur al selection of antivira l response of human body,anti-rabies vi-rus(RVa ntibodies play a n important role in the prophylax is and treatment of r abies.Nowadays,besides tra-ditiona l polyclonal immunoglobulin,ther e are anti-RV monoclonal antibodies(mAband ge

4、netic engineer ing a ntibodies which ar e still being in hot r esearch.Anti-RV glycoprotein mAb ar e mainly used in the RV post-exposure prophylaxis and trea tm ent,a pply ing the cocktail of several mAb against different epitopes of viral g lycopr otein w orks better than polyclonal immunoglobulin

5、in the prophy laxis of r abies.S till,there ar e many barr iers for applying mAb in the treatm ent of r abies,for examples,blood br ain bar rier stops antibodies fr om enter ing the centr al ner vous system and mAb have little effect on rabies vir uses tha t par asite in the neuro-cytes.Here is to m

6、ake a r eview on the latest development of mAb in the pr ophylaxis a nd treatment of rabies.Key words :Monoclonal antibody;Ra bies;Rabies vir us;Pr ophylaxis狂犬病是由狂犬病毒(ra bies virus,RV引起的一种人畜共患疾病,临床表现为急性进展性脑脊髓炎,病死率接近100%。狂犬病主要在经济欠发达地区流行,据报道全世界每年约有55000人死于该病,其中多数为儿童1。我国也是狂犬病流行区域之一,平均每年有1500多病例,约半数发生在广

7、西、湖南、贵州三省,在这三省犬携带RV 率高达2.3%2。目前应对狂犬病仍以预防为主,一旦有明显临床症状,即便按照经典的“M ilw aukee protocol ”治疗,也极少有存活病例3-4,因此迫切需要探索有效的治疗方法。体液免疫一直在机体对抗病毒感染中担任着重要角色,RV 的接触前、后预防也是通过主动或被动增加机体的体液免疫来实现的。抗RV 抗体用于防治狂犬病颇受关注,从传统的抗RV 多克隆抗血清到现在的单克隆抗体(m onoclona l a ntibody,mAb、小分子抗体都做过多次尝试,有多种已用于临床预防治疗中。1 抗RV 抗体1.1 抗RV 多克隆免疫球蛋白 抗RV 多克隆

8、免疫球蛋白主要从主动免疫后的人或马的外周血中分离提纯而得,即人源或马源抗RV 多克隆免疫球蛋白,含有抗RV 糖蛋白(glycoprotein,GP、核蛋白(nucle-oprotein,NP等多种成分的抗体。RV-GP 镶嵌于病毒外膜上,表位多且结构复杂,可以和运动终板及神经元细胞上的相应受体结合,并使病毒侵入细胞内部5-6,其对应抗体具有保护作用;RV-NP 与核酸组成核衣壳,位于病毒内部,不能引起保护性免疫应答。多克隆免疫球蛋白主要通过饱和式结合RV-GP 多个表位而使病毒失活,现在仍应用在RV 接触后预防中。然而,多克隆免疫球蛋白的来源有限,易导致某些疾病传播,并且异源性多克隆免疫球蛋白

9、还可引起变态反应性疾病,这些应用中的不足均促进了对抗RV m Ab 的研究7。1.2 抗RV-GP 杂交瘤m Ab 自1975年K hler 等8提出杂交瘤技术后,至今已产生几十种抗RV-GP mAb,并且根据这些m Ab 结合RV-GP 位点不同,将RV-GP 上的抗原位点大致分为三类:抗原位点G 、抗原位点G (氨基酸34200、抗原位点G (氨基酸330357。最近有研究还发现结合RV-GP 氨基酸2182409、氨基酸26126410的mAb 也可以中和RV 。G 为线性表位,G 、G 表位多而复杂,对RV 的侵袭能力有重要作用,尤其是G 位点第333位精氨酸被认为是影响RV 毒力的关

10、键残基,其被谷氨酸或甘氨酸替代后,病毒毒力明显降低,因此对应G 、G 位点的mAb 中和病毒能力也较显著。mAb 不像多克隆抗体那样可以结合RV-GP 多个表位,因此不同表位的m Ab 中和RV 的能力有很大差别,Ir ie 等11在研究mAb 中和RV 机制时发现,中和一个病毒粒子,构象表位特异性m Ab 最多需要20个分子,而线性表位特异性m Ab 则需要250多个分子,这是因为线性表位特异性m Ab 需要覆盖病毒粒子表面多数抗原位点才能中和病毒,而构象表位1特异性m Ab和对应抗原位点结合后可以使周围RV-GP三聚体发生拓扑似的构象改变,只需要少量抗体结合就可以中和病毒。但这并不意味着构

11、象表位特异性抗体一定比线性表位特异性抗体优越,有研究还发现RV-G P存在一种酸敏感性构象表位,由于分子间相互作用,局部H+增多而使表位构象改变但不影响病毒入侵能力,因而该表位的抗体不能完全中和病毒12。将mAb应用于临床狂犬病的预防治疗中,需要经过严密的筛选和实验,目前已经有多种通过临床试验并用于实践中。相对于多克隆免疫球蛋白,mAb 有自身的优势,更易获得人源性抗体,并且一经获得克隆株可随时制备。为了避免RV表型变异(如多糖修饰或基因型变异等使mAb失效,可将不同表位的mAb联合应用13,这样起到类似多克隆免疫球蛋白的效果,又保留了m Ab的优点。1.3抗RV-GP小分子m Ab 随着基因

12、工程抗体技术的进展,各种抗RV-G P小分子mAb库构建成功14-15,并由此筛选制备Fab抗体、单链抗体等。小分子抗体组织渗透能力强,可以率先达到局部组织,还可以和其他蛋白融合表达制备双功能抗体,如抗RV-GP单链抗体和碱性磷酸酶融合表达用于RV快速检测16。然而,小分子抗体抗原结合能力不及完整mAb,并且相对分子质量越小在体内代谢清除速率越快,因此将小分子抗体应用到狂犬病的预防和治疗中,需要综合考虑这些因素。在RV接触后预防或狂犬病早期治疗过程中,联合使用完整抗体和小分子抗体能否起到快速且持久的效果,仍值得尝试和研究。1.4抗RV-N P m Ab RV-N P为病毒的核衣壳蛋白,其对应m

13、 Ab不能中和病毒,但在感染宿主细胞中RV-N P 的表达水平远远高于RV-G P,这使抗RV-N P m Ab在狂犬病早期诊断中占有优势。从狂犬病可疑患者曾经咬伤部位及颈背部多点细针吸取骨骼肌组织,利用抗RV-NP mAb进行组织化学染色,从形态学上进行诊断,再配合现在高速发展的分子生物学技术,如实时定量反转录PCR17和环介导等温扩增技术18,方便狂犬病患者的早期诊断并为及时采取治疗措施争取了时间。2 m Ab在狂犬病预防中的应用一般情况下接触特定RV毒株后及时注射相应m Ab可以起到很好的预防作用,但是mAb难以应对病毒多样而复杂的变异,即使多mAb混合使用或者多克隆免疫球蛋白在某些人为

14、因素面前也面临着挑战。RV除了基因复制过程中的错误和紫外线照射发生变异外,还可通过不同毒株间同源重组而产生新的变异株19。显然无论是RV自然变异,还是人为性突变,m Ab在未来的狂犬病预防中都表现出滞后性。随着分子生物学的发展,通过基因突变技术提前预测可能的变异,制备相应分子模式的m Ab可防患于未然。3 m Ab在狂犬病治疗中存在的问题3.1RV隐匿性侵袭及血脑屏障作用RV从周围组织侵入机体后,在局部骨骼肌组织内潜伏并自我复制,一段时间后,经运动终板进入运动神经纤维,继而逆行侵入脊髓背根神经节,然后达到中枢神经系统(主要是小脑和海马区,最后沿感觉神经纤维逆行感染全身组织脏器。在侵入神经元细胞

15、前期, RV表现出隐匿性入侵特征,如低RNA复制,低RV-GP抗原表达以逃避机体免疫系统的攻击,此时无明显症状,多疏于防范。一旦RV侵入神经元细胞,便在很短的时间进入中枢神经系统,此时患者也逐渐表现出各种特征性的临床症状,血清内RV抗体水平逐渐升高,但不能中和中枢神经系统内的病毒,其原因是血脑屏障(blood-brain ba rrier,BBB的作用使抗体等免疫性因子无法进入中枢神经系统发挥作用。近年来,Fa bis等20从狂犬病动物模型试验中得出这样的结论,BBB在完整状态时,特异性免疫应答细胞、中和性抗体很难进入中枢神经系统;如使BBB 的通透性适度增加,中和性抗体等则可进入中枢神经系统

16、清除RV,且不引起明显的免疫病理损伤。Kuang等21实验中还证实,一些RV毒株致病能力弱是由于病毒诱导机体产生较多的干扰素诱导蛋白10、巨噬细胞炎性蛋白1等因子,它们可以增加BBB的通透性并促进特异免疫因子向中枢神经系统内渗透。如果脊髓神经鞘膜下直接输注中和性单克隆,跳过BBB的屏障作用,应该可以很好地清除胞外的RV,相对延缓病情进展。有实验也证实中枢神经系统内高水平中和性抗体能够很好地清除胞外的RV,防止病毒侵入神经元细胞22-23。3.2mAb难以中和细胞内RV 在机体抗病毒免疫过程中,体液免疫主要清除细胞外的病毒,细胞免疫用于清除病毒感染细胞,因此mAb对狂犬病患者的治疗作用还很有限,

17、但过多的细胞免疫成分进入中枢神经系统会引起神经元细胞死亡,对狂犬病患者尸检标本组化染色可以观察到切片局部大量CD4+/CD8+T淋巴细胞凋亡,并伴随着少量神经元细胞凋亡24。如何清除病毒的同时尽量维持中枢神经系统的完整性,也是狂犬病治疗中的难点之一。3.3RV致病的多因素性狂犬病的高致死率,还与病毒基因组表达的磷蛋白(phosphoprotein,PP、基质蛋白(ma trix protein,MP有关。RV-PP是病毒2RNA多聚酶的辅因子,参与病毒RN A复制,辅助RNA与N P组装成核衣壳,并且在RV的逆神经轴突播散中发挥一定作用25。最近研究发现,RV-PP可以通过信号转导与转录激活因

18、子(signal tra nsducer a nd activa tor of transcription,S TAT1、S TAT2结合抑制干扰素介导的J AK/S TAT信号途径26,或通过抑制干扰素调节因子3活性降低干扰素的诱导表达,并影响J AK/S TAT信号途径27,藉此病毒可以抑制感染细胞凋亡并存活于细胞内。RV-M P也参与病毒的组装,并且影响病毒从胞内释放。Finke等28将弱毒株欧洲蝙蝠源RV的M基因(编码基质蛋白重组进M基因缺失的RV中,重组病毒感染细胞后释放减少,病毒RN A在细胞内大量积累。并且RV-M P 还可以通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导途径和抑制细胞色素C氧化酶

19、途径诱导细胞凋亡29,这也可能是RV致神经系统病变的重要机制之一。因此,抗RV-GP m Ab单独应用在狂犬病治疗中价值很有限,还需要从多种途径上进行干预,如病毒毒性蛋白的表达、病毒组装、病毒向胞外释放等。4 结语和展望自然界选择了抗体作为机体对抗病毒入侵的方式之一,人类也利用各种技术制备mAb用于病毒性疾病的预防和治疗。在RV接触后的预防中,抗RV-GP不同表位的m Ab联合应用既有多克隆免疫球蛋白的中和效果,又有m Ab安全可靠等优点。如果对RV-GP关键表位进行基因突变,研究各种可能的变异,还可以预先制备抗强毒株的mAb用于狂犬病预防。针对侵入神经元细胞内的病毒除了采用抗病毒药物外,细胞

20、内抗体技术也是研究热点,如细胞内抗RV-PP m Ab可以抑制小鼠神经元细胞内RV的增殖30。因此,mAb为狂犬病的预防和治疗开辟了更为广阔的前景。参考文献1Knobel DL,Clea veland S,Coleman PG,et al.Re-evaluating theburden of rabies in Afr ica and AsiaJ.Bull World Health Or gan,2005,83(5:360-368.2S ong M,Tang Q,Wang DM,et al.Epidemiological investigations ofhuman rabies in Chi

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