TRIZOL法提取总RNA（课堂PPT）

1、.1实验总体安排实验总体安排1大鼠大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定：基因的钓取、克隆和鉴定：大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶）RT-PCR产物的胶回收连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆）挑单克隆，摇菌过夜、提质粒酶切鉴定，电泳检测.2专题 2.human IL8 ELISA检测 3.报道系统的单光子检测.3TRIZOL法提取总RNA.4简介 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。.5 Trizol是直接从细胞

2、或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀火的RNA.6RNase 它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，包括枪头和EP管等.7RNase处理 所有玻璃器皿均应于使用前180干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1DEPC浸泡或用氯仿洗涤。 全部实验过程最好戴一次

3、性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。 配制的溶液应尽可能用0.1DEPC在37处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。 .8从组织中提取RNA 本实验目的：提取大鼠总RNA 组织来源：大鼠肝脏。 每组做两个样品.9步骤 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂。匀浆。 移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温23min。 4离心，12,000g15min。 仔细吸取上层水相，移至另一

4、Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4离心，12,000g10min。 弃上清，加75乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4离心，7500g5min。 弃上清，空气干燥5-10min，加入50l无RNase水重悬沉淀。 核酸定量或电泳检测。多余样品-70保存备用。.10注意事项 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套 样品量和Trizol 的加入量一定要按步骤（1 ）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不

5、完全，导致RNA 降解。 .11电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法 琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。.12 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗

6、略估计样品DNA浓度。.13注意事项 EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。.14实验步骤（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（2）冷却到60，加入1l的0.5mg/ml EB，并摇匀。（3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。（4）将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。（5）用移液器吸取总RNA样品5l于封口膜上，再加入1l 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点

7、样孔。(6) 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min。 .15.16上样上样.17.18电泳检测结果：电泳检测结果： RNA提取：提取： 关键关键 防止防止RNARNA降解降解RNA提取的成功与否提取的成功与否是是RT-PCR检测中最检测中最重要的步骤。重要的步骤。.19核酸定量 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276 nm，胸腺嘧啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收

8、峰不会改变。但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。 .20 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。 DNA样品的浓度为：OD260核酸稀释倍数 50/1000（ug/ul） RNA样品的浓度为：OD260核酸稀释倍数 40/1000（ug/ul） .21 故根据OD 260 /OD 280的比值可以估计核酸的纯度： DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有

9、RNA污染， 若RNA样品比值高于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。.22实验步骤 取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE）至100ul，混匀。 将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读数。核酸定量仪将直接给出样品浓度。 .23RT-PCR.24RT-PCR RNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCR）是以）是以mRNA为模板进行逆转录反应（为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与）与PCR，可用于检测，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的个

10、拷贝的RNA模板。模板。mRNAcDNAPCR产物产物.25反转录反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCR特异性引物, Taq酶Oligo dT, 逆转录酶用途用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、mRNA丰度.26RNA、缓冲液、缓冲液、dNTP、逆转录酶、逆转录酶、引物（随机引物引物（随机引物:Oligo dT)5AAAAAAAA3TTTTTTTTmRNAcDNA1.逆转录：逆转录：.27实验步骤 取1g总RNA于一PCR管，70反应10min，轻轻离心后置于冰上。 2）建立20l RT反应体系： MgCl2 4l 10RT

11、缓冲液 2l dNTP Mixture（10mM） 2l（1.25mmol/L） RNase inhibitor 0.5l 逆转录酶 1l（200U） Oligo(dT)15引物 1l 总RNA 1g 加无核酶水至总体积 20l 涡旋混匀，42反应15分钟，95加热5分钟，0-55分钟。.28AAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5 cDNArTaq2.2.PCRPCR: :GAPDHGAPDHGAPDH (sense)GAPDH (antisense)cDNA、缓冲液、缓冲液、dNTP、rTaq、引物、引物（特异引物（特异引物)、Mg2+.29实验步骤 建立PCR反应体系： RT获得逆转录反应得到的cDNA 5l 5.0M的GAPDH混合引物 2l 10PCR buffer 5l 10mM dNTPs 1l Taq DNA聚合酶 0.5l MgCl2 4l d