Affymetrix全转录本芯片实验流程

1、 Whole Transcript 芯片实验流程简介简要流程 各个步骤所需时间第一天 rRNA 消减 1.5小时 (仅针对 Exon 芯片 第一次循环, cDNA 合成 3小时cRNA 合成 16小时第二天第二次循环, DNA 一链的合成、片段化及标记 8小时 杂交第三天 第 天洗涤、染色和扫描 2小时 实验的起始PolyA 的参入Gene Array RNA起始量 100ng 300ng Exon Array RNA起始量 1ug 2ug根据操作手册中的比例,参入 poly A内标记 rRNA 的消减和检测针对 Exon 芯片 片使用 Agilent BioAnalyzer 2100检测消减

2、结果 RNA 消减后 的纯化 rRNA 消减结果检测 (Exon 芯片第一次循环,cDNA 一链的合成加入含有 T7的随机引物 70度 5分钟, 4度至少 2分钟配制 cDNA 第一链合成试剂 分钟 分钟 分钟 25度 10分钟, 42度 60分钟, 70度 10分钟, 4度 2分钟 第一次循环,cDNA 二链的合成氯化镁的稀释二链合成体系的配制 16度 120分钟(无热盖, 75度 10分钟(加热盖, 4度 2分钟。 cRNA的合成和纯化1. cRNA 合成体系的配制2. 37度 16小时(过夜 IVT3. 第二天使用纯化柱纯化 cRNA4. 两次洗涤提高产量5. Nanodrop 测定浓度

3、6. -80度可保存 cDNA一链的合成 70度 5分钟, 25度 5分钟, 4度 2分钟 2510427010425度 0分钟, 度 90分钟, 0度 0分钟, 度 分钟 cRNA的水解和 DNA 单链的纯化加入 1. RNaseH37度 45分钟, 95度 5分钟, 4度 2分钟。2. 使用试剂盒对 DNA 单链进行纯化3. Nanodrop 进行定量4. -20度保存 DNA单链的片段化DNA 单链溶液配置 Frag 体系配置 37度 60分钟, 93度 2分钟, 4度 2分钟BioAnalyzer 2100检测, -20度保存 DNA单链片段化结果检测 片段化后DNA 单链的标记 37

4、度 60分钟, 70度 10分钟, 4度 2分钟 杂交体系的配置 杂交条件45度, 60rpm , 17±1小时 洗涤,染色和扫描1. 采用 Affymetrix 洗涤染色试剂盒2. 根据 protocol ,分装不同的染色液3. 根据芯片类型,选择不同的洗涤程序4. 洗涤和染色大致为 90分钟5. 根据芯片的不同,扫描时间不一 芯片质控和数据分析 1. 芯片扫描图片观测 2. 使用Expression Console进行QC 3. 选择其它软件进行高级数据分析 Th W The Way Ahead. Ah d ©2004 Affymetrix, Inc. All righ

5、ts reserved. Affymetrix, the Affymetrix logo, and GeneChip, and The Way Ahead are registered trademarks and CustomExpress, q, NetAffx, , and Tools to take you y as far as your y vision are trademarks owned or used by y Affymetrix, y , Inc. MegAllele g is a trademark of ParAllele CustomSeq, BioScience. Array products may be covered by one or more of the following patents and/or sold under license from Oxford Gene Technology: U.S. Patent No's. 5,445,934; 5,744,305; 6,261,776; 6,291,183; 5,700,637; 5,945,334; 6,346,413; 6,399,365; and 6,610,482 ; and EP 619 321; 373 203 an