_一测多评_法中药质量评价模式方法学研究

1、学术探讨一测多评 法中药质量评价模式方法学研究王智民 *, 高慧敏 , 付雪涛 , 王维皓(中国中医科学院 中药研究所 , 北京 100700摘要 ! 目的 :建立适合于中药特点的利用 1个对照品同步 测定多成分 的分析方 法 , 并建立其 方法学 的考察 模式。 方法 :以木通为研究对象 , 以药材中 典型成分皂苷 P J 1(sapon i n P J1 为指标 , 建立该成分 与其他成 分白木通皂 苷 B 和白木通皂苷 C(m utongsapon i n B 和 C 间的相 对校正因子 , 测 定 sapon i n P J 1的含量 , 用校正 因子计算 m utong saponi

2、 n B 和 C 的含量 ; 同时采用外标 法实测药材中 3种 成分的绝对含 量 ; 采 用夹角余弦 法对一测多 评法的 计算值 与外标法实测值进行比 较 , 评价一测多评法的准确性和科学性。 结果 :建立了一测多 评法方法学 的考察模式 ; 方法 准确性评价结果表明一 测多评法的计算值 与外 标法 实测值 之间 没有显 著性 差异 , 实验 所得 的校正 因子 可信。 结 论 :一测多评的研究思路在木通药材中得到验证 , 有望成为适合中药特点的多指标质量评价新模式。关键词 ! 一测多评 ; H PLC ; 木通 ; 校正因子中图分类号 R 284. 1! 文献标 识码 A ! 文章编号 10

3、01 5302(2006 23 1925 05 收稿日期 ! 2006 09 08通讯作者 ! *王智 民 , Te:l (010 84014128, E m a i :l z hmw123263. net! ! 中药质量控制和 评价是中药现代化的 瓶颈 , 中 药多成分 的复杂性决定了单一 成分或指标评价难以 表达中药的 质量 , 并由此提出 多成 分 质量 控制 的 模式 ; 多 指 标的 质量 评 价模 式 , 必需有足够量的 化学对 照品 , 由 于中药 化学 对照品 分离 难度大或单体不稳定难以供应 或供应价格高 等因素 , 致使对 照品的供应和使 用力 不从 心。鉴于 目前单 成分

4、 质量控 制尚 缺乏对照品供应 , 更 不用说 多指 标成分 的质 量控制 模式 , 该 模式也仅限于科研 , 难以应用到实际 质量监督和 评价中。故 有人提出增加指纹图谱进行质 量控制的模式 , 但指 纹图谱的 模糊性特点决定了 其在实 际生产、 监督 中应 用的难 度和 难 以说清楚 的局面。那 么能否 通过中 药有效 成分间存 在的内 在函数 关系和 比例关系 , 仅测定 1个成分 (对照品可以得到者 , 来实现 多个成分 (对照 品 没 有 或 难以 供 应 的 同 步 监 控 , 这 是 一测多评 的基本 设计思想。作者以木通药材为例 , 采用 一 测多评模 式对其 中 3种 皂苷类

5、 成分进 行同步 测定 , 对一 测多评方法的技术适 用性和应用可行性进行了探索和评价。 1! 仪器与试药W a ters 2695-2996高 效液相系统 , E m pow er 工作站 (Wa ters 公司 ; A g il ent 1100高效 液 相系 统 , 白 木 通皂 苷 B (mu tongsapon i n B , 皂 苷 P J 1(sapon i n P J1 和 白 木通 皂苷 C (mu tongsapon i n C 对照品 由本 实验 室分 离纯 化并 鉴 定结 构 (图 1, HPLC(面积归一 化法 纯度 >98%。白 木通 药材采 自四川 , 经本

6、所生药室何希荣主管技师鉴定 为白木通 A keb i a trifo li a t a (T hunb . K o i dz . var . australis (D i e ls R ehd 的干 燥藤 茎 , 其他样品由本所生药室郝近大研 究员鉴定 提供。甲醇为 色谱纯 , 水为高纯水 , 其余试剂均为分析纯。图 1! 对照品白木通皂苷 B , 皂苷 P J1和白木通 皂苷 C 2! 方法与结果 2. 1! 方法原理在一定的 范围内 (线性范围内 成分的 量 (质量或 浓度 与检测器响应 成正比 , 即 :W =f A 1 3。在多指标质量评 价时 , 以药材中某一典型组分 (有对照品供应

7、者 为内标 , 建立该组 分与其他组分之间的相 对校正因子 , 通 过校正因子 计算其他 组分的含量。这种测定 一个成分 , 实现 对多个成分 定量的方 法命名为一测 多评法。假设某样 品中含有 i 个组分 ! !W iA i=f i (i =1, 2, , k , , m ! #式中 A i 为组分峰面积 ; W i 为组 分浓度。选取其中 一组分 k 为内标 , 建立组分 k 与其 他组分 m 之间的相对校正因子 4 6。! ! f km =f k f m =W k A mW m k ! %由此可导出定量 计算公式 :! ! W m =W k A mf km k! &式中 A k

8、为内标物 峰面 积 , W k 为 内标 物浓 度。 A m 为 其他 组分 m 峰面积 ; W m 为其他组分 m 浓度。 2. 2! 一测多评方法学 7考 察2. 2. 1! 色谱条 件 ! 色谱柱 A llti m a C 18(4 6mm 250mm, 5 m , 流动相甲醇 (A 乙 腈 (B 0 1%磷 酸水 (C , 梯度洗 脱程 序 见表 1, 流 速 1 0mL m i n -1, 柱 温 30 , 检测波长 210n m 。上 述 色 谱 条 件 下 , 各 组 分 分 离度 良 好 (图 2 。表 1! 流动相梯度洗脱程序t /mi n A /%B /%C /%03556

9、040152560 图 2! 对 照品及药材的 H PLC 图A . 对照品 ; B. 样品 ;1. mu t ongsaponin B; 2. sapon i n P J1; 3. m u t ongsapon i n C2. 2. 2! 对 照 品溶 液的 制 备 ! 分 别精 密称 取 mutong saponin B , saponi n P J1和 mutongsapon i n C 对 照 品 1 52, 4 03, 2 0mg 置于 10mL 的 量 瓶 中 , 甲 醇 溶 解 并 稀 释 至 刻 度 得 0 152, 0 403和 0 20mg mL -1的混合对照品 溶液。精

10、密称 取 sap on i n P J1对照品 4 06m g 置于 10mL 的量瓶中 , 甲醇溶解并稀 释至刻度得 0 406m g mL -1的单一对照品溶液。2. 2. 3! 供试品 溶液的制备 ! 取药材粉末 (过 60目筛 约 1 0g , 精密称定 , 置具塞三角 瓶中 , 精 密加入 70%的 甲醇 50mL, 精密称定 , 超声提 取 30m i n , 补足 重量 , 摇 匀 , 滤过。精 密量 取续滤液 30mL, 减压蒸干溶 剂 , 残 渣以 10mL 水分次 洗涤 , 洗涤 液并入分 液漏斗 中 , 以水饱 和醋酸 乙酯萃取 3次 , 每次 10mL , 弃去醋酸乙酯

11、液 , 水 层用 水饱和 正丁 醇萃取 5次 , 每 次 10mL, 合并萃取液 , 置蒸发皿中蒸干 , 残渣以 70%甲醇溶 解、 洗涤并定容于 5 0mL 量瓶中 , 过 0 45 m 微孔 滤膜 , 即 得。2. 2. 4! 线性范围 ! 精密吸 取上述 混合对 照品 溶液 1, 5, 10, 15, 20 L 进样 分析 , 以 进样 量对 峰面 积积 分值 进行 回 归处 理 , 得 m utongsapon i n B , saponi n P J1, mutongsapon i n C 回归方程 分别为 :Y =548105C -3778(r =0. 9997, Y =28528

12、1C -2822(r =0. 9999, Y =252842C -513(r =0. 9998 。三者分别在 0 153 04, 0 408 06, 0 204 0 g 线性良好。 2. 2. 5! 校正因子 计算 ! 以 Sapon i n P J1为内标 , 按 2. 1项下公 式 %, 分别计算 sapon i n P J 1对 m utongsapon i n B 和 mu t ongsapo n i n C 的校正因子 , 见表 2。表 2! 校正因子进样体积 / Lf sapo nin P J 1/mutong sapo nin Bf saponin P J1/mutongsapo

13、n i n C11 9120 81151 9180 863101 9210 871151 9230 890201 7600 900M ean 1 8870 867RSD /%3 763 992. 2. 6! 精密度试 验 ! 精密吸取同一混合对照品溶液 20 L, 连续 进样 6次 , 记录 峰 面积 , m utongsapon i n B , saponi n P J 1和 m ut ongsapon i n C 峰 面 积 的 R S D 分 别 为 1 7%, 1 8%和 2 0%。2. 2. 7! 稳定性试验 ! 取同 一供试 品溶液 分别于 1, 2, 3d 进 样分 析 , 记

14、录峰 面积 , mutong saponi n B , saponi n P J1和 m utong saponi n C 的 R S D 分别为 1 7%, 1 7%和 0 65%, 表明处理后 的样品溶液室 温放置 3d 稳定。2. 2. 8! 重复性试 验 ! 称取白木通 (四川峨嵋山麻柳村 药材 粉末 (60目 约 1 0g 共 6份 , 精 密称 定 , 按 供试 品溶 液处理方法 制备样 品 , 测定 , mutong saponi n B , saponi n P J1和 m utong saponi n C 的 平 均 含 量 为 0 15%, 0 65%和 0 18%, RS

15、D 为 1 7%, 1 5%和 1 3%。2. 2. 9! 加样回收率 ! 精密称取适量已知含 量的白木通药材 粉末 (60目 6份 , 分别 加入一 定量 的对照 品 , 按 供试品 溶液处理方法 制备 样品 , 测 定 , 计算 加样 回收 率 , m utong saponi n B ,sapon i n P J1和 mutong saponin C 的 平 均 回 收率 为99 7%, 97 4%,99 4%, RSD 为 2 4%,2 6%和 2 9%。 2 2 10! 样品测定 ! 分别 精密 吸取 供试 品、混合 标准 品及 单一标 准品 (saponi n P J1 溶 液各

16、5, 10, 10 L 注 入高效液相色谱仪 , 测 定。分别 采用 一测多 评法 和外 标一点 法计算木通 药材中 m utongsapon i n B , sapon i n P J1和 mu t ongsaponinC 的含量 (表 3 。2. 3! 一测多评方法耐用性和系统适应性评价2. 3. 1! 色谱柱及 高效液相色谱仪考察 ! 取 2. 2. 2项 下混合 对照品溶液 , 进样 1, 5, 10, 15, 20 L, 测定 , 按 2. 2. 5项下计 算 sapon i n P J1对 mutongsapon i n B 和 m utongsapon i n C 的 校正 因子

17、。试验考察 了 W a ters 2695-2996, A g ilent 1100两种 高效 液相色谱系统 和 A g ilent C 18(4 6mm 250mm , 5 m , P he no m enex L una C 18(4 6mm 250mm , 5 m , A llti m a C 18(4 6mm 250mm, 5 m 3种色谱柱 , 结果见表 4。2. 3. 2! 实验室考察 ! 采用建立的一测多评 试验方法在经两! ! 表 3! 不同来源木通药材中 3种皂苷类成分的含量 (一测多评法和外标法 药材 产地m u t ongsapon i n B /%测定 计算sapon

18、i n P J1测定/%m u t ongsapon i n C /%测定 计算白木通 ! 四川峨眉 ! 0 0660 0690 3250 1740 174 ! 四川双福镇 0 1070 1130 3790 1420 141 ! 四川悦连乡 0 0560 0590 2980 0910 091 ! 四川筠连 ! 0 1360 1430 6300 1770 176 ! 四川黄湾乡 0 0610 0650 3570 0700 069 ! 四川大庙乡 0 0500 0520 2390 0750 075三叶木通 安徽绩溪县 0 0420 0440 2710 1180 117 ! 安徽城关镇 0 1380

19、 1450 8080 1600 159 ! 安徽霍山县 0 0470 0500 3510 1570 156 ! 安徽泾县 ! 0 0120 0130 5460 0570 056 ! 江西修水县 0 0600 0630 3150 1960 195 ! 江西武宁县 0 0440 0460 2940 1710 170 ! 江西瑞昌市 0 0430 0460 4600 1850 184表 4! 不同仪器和色谱柱测得校正因子 (n =5仪器 色谱柱校正因子f sa po nin PJ1/m utongsa po nin Bf saponin PJ 1/mutongsapon i n CW at ers

20、! A gil en t 1 8800 873 ! ! Lun a 1 8580 871 ! ! A ll ti m a 1 8870 867 Ag il en t ! A ll ti m a 1 9020 884 M ean ! 1 8820 874 RSD ! 1 0%0 8%个实验室进行复核试 验 , 结果见表 5。表 5! 不同实验室测得校正因子进样体积 / L f sa po nin PJ1/mutong saponin Bf saponin PJ1/mutongsapon i n C Lab . 1Lab . 2Lab. 1Lab. 211 9121 8670 8110 849 5

21、1 9181 9170 8630 872 101 9211 9320 8710 878 151 9231 9450 8900 899 201 7601 9370 9000 895 M ean 1 8871 9200 8670 878 2. 3. 3! 待测组分色谱峰 的定位 (专属性 ! ! 方法一 :利用相对保留时间 (RT 差 定性 :知道内 标峰的 保留时间 , 加上相对保留时间差 , 再根据峰形 判断 , 即能够正 确判断出目标 峰的准确峰位置 (表 6 。方法二 :光谱相关 色谱 :同样 的成分 , 在 不同色谱柱及色 谱仪器中的保留时间有 些差异 , 但他们的光谱 (或质谱 相同

22、或相似。通过对所 有不 同流出 时间 点的光 谱与 纯物 质之间 的光谱匹配程 度。再结 合目标 峰所 在原色 谱峰 簇的 保留时 间信息 , 即能够正确判断出目标峰的准确峰位置。2. 4! 一测多评方法与常规法比较研究将 常规的 外标法 实测含 量与一 测多评计 算的含 量采用 夹角余弦值进 行比较 , 验证一测多评方 法用于多指 标成分质 量评价的准确 性。夹角余弦 值计算公式 8 9:S =ni =1xiyi=1(xi2=1(yi2本实验采 用一测 多评 法和 外标 法测 得的 mu t ongsaponin B 和 m utongsapon i n C 的 计算值 和实测 值之间 的夹

23、角 余弦值 分别为 0 99998和 0 99999, 表明两种方法测得含量没有显 著性差异。表 6! 各组分保留时间及相对保留时间差仪器 ! 色谱柱 RT m utong sapo nin B RT saponin P J1-RT m utongsapon i n B RT saponin P J 1RT sapo nin P J 1-RT mutong saponin RT m utongsapon i n C W aters ! Ag il en t 23 79810 05533 853-3 36437 217 ! ! Luna 22 36510 45732 822-3 30836 13

24、0 ! ! A llti m a 24 7409 91434 654-3 19437 848 Agilent ! A llti m a 26 79610 01136 807-3 08439 891 M ean ! 24 42510 10934 534-3 23837 7712. 5! 方法再验证随机选择另外的 木通药材 , 分 别按 实测 法 和 一测多 评法 (按试验建立的校正因子 计算 m utongsapon i n B 和 mu tongsapon i n C 的含量 , 验证一测多评法的科学性和适用性。 3! 讨论 3. 1! 本试验以木通药 材为例 , 通 过方法学确证、 方法的耐

25、用 性、 系统适应性考察 和一测 多评 准确性 的评 价 , 对一 测多评 法的技术适用性和应用 可行性进行了探 讨研究。结果 表明 , 一测多评法推 算的含量与实测法所得含量 没有显著性 差异 , 提示试验建立的校正因 子比较可信 , 能够实 现在 mu t ongsapon i n B 和 m utongsapon i n C 对照 品缺乏 的情况 下 , 通 过 saponin P J1与 mutong saponin B 和 mu t ongsaponin C 之间相对 保留时间 差的进行色谱峰定 位 , 利用 saponin P J1和校正 因子计算 两者 的 含 量。 实 验 所

26、得 的 相 对 保 留 时 间 差 RT sapon i n P J1-RT muto ng saponin B 和 RT saponin P J1-RT m utongsapon i n 的平均 值为 10 1096和 -3 2372m i n , 校 正 因 子f sapon i n P J1/mutongs apo nin B 和f s apo nin P J 1/mutong saponin C 的平均值 1 882和 0 874可供 他人参 考和使用。3. 2! 本试验的两个 重点是专属性和校 正因子问题。从本实 验可以看出 3个皂 苷成 分在不 同柱 子和仪 器上 出峰时 间有 所

27、变化 , 但相对保留 时间差 变化 不大 , 所以 利用 相对保 留时 间 差能较好 的解决 专属性 问题。本实 验只考 察了 3个成分 在同 比例时 的校正 因子 , 且 3个 成分都 属于同 一类化 合物。 在后续实验中将对不 同比例 , 不同类化 合物之间的 校正因子 进行研究。3. 3! 本试验采 用外标法实测组分的绝 对含量与一 测对评法 推算含量进行比 较 , 评价一 测多 评方 法的准 确性 和科学 性。 目前评价两组数据的贴近程度 的方法主要有 相关系数 法、 夹 角余弦值法、 模糊分布 法和模 糊欧式距 离法 10,11, 根据 试验 结果 , 本研究借鉴了中药色谱指纹图谱

28、进行相似度 评价常用 的夹角余弦算法和统 计学上 t 检验。3. 4! 在中药多指标 质量评 价过 程中 , 多采 用指 纹图谱 技术 来体现中药的整体性 , 但它太过模糊的 特点造成了 在实际生 产、 监督中的应用难度和 难以说清楚 的局面。一测多评的 研究思路侧重从量 上阐 明主要 成分 或药效 成分 间的相 互关系 , 校正因子的运用 能够实 现在 对照品 短缺 的情 况下 , 多指 标成分的含量 测定 , 有望成为适合中药 特点的多指 标质量评 价新模式。 参考文献 1! 喻华达 . 无纯样色谱校正 因子的测定 J.化学世界 , 1992, 7:816.2! 陈忆庭 . 药物的紫 外百

29、分吸 收系数用 于 H PLC 定量 测定的方 法探讨 J.中国现代应用药学杂志 , 2002, 19(4:315. 3! 李 ! 聪 . 紫外检测器定量校正 因子的性质与 实用性探讨 J .色谱 , 1990, 8(4:254.4!黄 ! 信 , 郑 ! 阳 , 曾泽玉 , 等 . HPLC 校正因子法测 定牛蒡子提 取物中总木脂素苷的含量 J.成都中医药大学学报 , 2005, 28(4:42.5! 李玉兰 , 刘 ! 敏 , 王 ! 玉 . 舒巴坦 钠中舒巴 坦青霉胺 杂质含量 测定方法的建立 J.中国药师 , 2005, 8(6:467.6! 吴益群 , 史咏梅 . 校正因子法测定替硝

30、唑葡萄糖注射液中 5 羟 甲基糠醛的含量 J.江苏药学与临床研究 , 2004, 12(6:6. 7! 中国药典 S.一部 . 2005:附录 114.8! 谢培山 . 中药 色谱指 纹图 谱 M 4版 . 北 京 :人 民卫 生出版 社 , 2005:141.9!王龙星 , 肖红斌 , 梁鑫淼 , 等 . 一种评价中药色谱指纹谱相似性 的新方法 :向量夹角发 J.药学学报 , 2002, 37(9:713.10! 刘永锁 , 孟庆华 , 蒋淑敏 , 等 . 相似系统理论用于中药色谱指纹图谱的相似度评价 J.色谱 , 2005, 23(2:158.11! 聂 ! 磊 , 曹 ! 进 , 罗国安

31、 , 等 . 中药指纹图谱相似度评价方法的比较 J.中成药 , 2005, 27(3:249.M ulti co mponents quantitation by one m arker new m ethod for qualityeval uation of Chi nese herbalm edi cineW ANG Zh i m i n , GAO H ui m in , FU Xue tao , WANG W e i hao(Instit u te of Chi nese M ateria M edica , Ch i na A cad e m y of ChineseM edici

32、al S ciences , B eijing 100700, Ch i naAb stract! O bjective :To estab li sh a ne w qua lity evalua ti on me t hod f o r Ch i nese herba lm edic i ne , usi ng one che m ica l re ference substance to calcu l a te mu lti components si m ultaneousl y . M eth od :R elative correcti on factors (RCF o fmu t ongsaponin B and C to sap on i n P J1, a character i stic component as ma rker ,