玉米转基因完整流程

1、农杆菌菌株的培养及感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（链霉素100mg/ml），28振荡培养过夜取过夜培养菌液500l接种于50mlYEB（链霉素100mg/ml）液体培养基中，28振荡培养至OD600为0.5 左右。5000rpm离心5min，集菌。加10ml0.15MNaCl悬浮细胞，5000rpm离心5min，加10ml预冷的20mMCaCl2悬浮细胞，冰浴，24小时内使用，或分装成每管200l，液氮中速冻1min，置于-70保存备用。植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化取200ml 感受态细胞，加入1g构建好的质粒DNA加入到，混匀后，冰浴30

2、min。液氮中速冻2-3min，37水浴5min，接着冰浴3min。加入1mlYEB培养基，28摄氏度慢速震荡培养4h。5000rpm离心5min，弃上清，集菌。加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB平板上，28培养阳性克隆的鉴定挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB液体培养基中，28振荡培养过夜，小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。农杆菌菌液的制备挑取继代2d后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，在28黑暗条件下震荡培养16-20h（

3、OD600）将菌液置于离心管中，18-20，5000rpm离心5min收集菌体。将收集到的菌体用2mlD-inf液体培养基悬浮进行洗涤，以去除残余的YEB培养基18-20，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用2mlD-inf液体培养基，加入1AS，备用（放1h）农杆菌感染玉米幼胚初生愈伤及共培养将加入到D-inf（含AS）的菌液稀释到OD600为0.3-0.5放置1h以上，将幼胚或愈伤用D-inf（不含AS）洗一次，再浸入菌液中，用手 上下颠倒30s，并放置5min，观察幼胚无明显伤口时，取出，用无菌滤纸吸干，放到D-AS固体培养基上，25黑暗条件下共培养3d，同时设对照。植物受体材

4、料幼胚、愈伤组织的制备愈伤组织的准备：玉米授粉后10-13d，取玉米幼穗在超净台上剥去苞叶，取出幼胚，将幼胚盾片朝上，接种于D培养基上，每培养皿接20-40个幼胚，28培养2-3d后，即可诱导出愈伤组织。幼胚的准备：剥去苞叶、丝及一些多余部分，用刀插入上部，放入70%的乙醇，进入超净台，30s，拿出，超净台上吹干约15-20min，剥去玉米粒的2/3的表面部分，剥幼胚。玉米转化体的筛选、继代和植株再生恢复培养的阶段：将共培养3d后的幼胚在灭菌水（加1的cef）中洗3次，每次20min，然后用滤纸吸干，转入D-cef固体培养基上，25，暗处，恢复培养7d。选择加压筛选阶段：分4次第一轮 D培养基

5、+cef（1）+PPT（5mg/ml）第二轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）第三轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）第四轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）每轮间隔均为2周；其中AgNO3可加（1或0.5）可不加，或一次加而另一次不加；cef使用浓度250mg/L，存储液浓度为250mg/ml；PPT存储液浓度为10mg/ml。筛选后的恢复阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖30g/L（或蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L），时间为2周，暗培养。筛选后的诱导阶段：D培养基+6-BA（5mg/L）

6、，其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖50g/L，不加葡萄糖+cef1ml/L，暗培养。分化阶段：D培养基，但不加任何激素，蔗糖浓度30mg/L不加葡萄糖，+cef1ml/L，光照培养。生根阶段： 培养基及母液的配置D-培养基NaFeEDTA 10ml/LN6 macro 50ml/LB5 micro 10ml/LDi comba(2,4-D) 1ml/L(5ml/L)RTV 10ml/LCasamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/L肌醇 100mg/LSucrose 20g/LPH 5.8N6大量元素组成成分 终浓度(mg/l） 20&#

7、215;（g/L）硝酸钾 KN03 2830 56.6硫酸铵(NH4) 2SO4 463 9.26硫酸镁 MgSO4·7H20 185 3.7 磷酸二氢钾 KH2PO4 400 2.58氯化钙 CaCl2·2H2O 166 3.32(或无水氯化钙CaCl2 2.58 ) 配2L时，称取6.64gCaCl2·2H2O溶于600-700ml蒸馏水中，称取其他成分溶于600-700ml蒸馏水中，分别溶解后，再混合到一起，定容至2000mlB5微量元素 组成成分 终浓度(mg/l） 100×（mg/500ml）MnSO4·H2O 10 378.93Mn

8、SO4·4H2O 10 500ZnSO4·7H2O 2.0 100H3BO4 3.0 150KI 0.75 37.5Na2MoO4·2H2O 0.25 12.5CoCl2·6H2O 0.025 1.25CuSO4·5H2O 0.025 1.25Fe盐组成成分 终浓度(mg/l） 100×（mg/500ml）Na2·EDTA 37.3 1.865 FeSO4·7H2O 27.8 1.390Na2·EDTA用温水溶解，放于50水浴，后将FeSO4·7H2O加入，定容至500ml。 Dicomba(M

9、W:221.0) 335.1mg/100ml=3.315mg/ml (15m) 用2,4-D母液200× 5ml/L（2g/L）RTV（100 ×，500ml体系）组成成分 终浓度(mg/l） 100×（mg/500ml） mg/1000mlChloride Acid （139.63） 0.0977 4.885 9.770（氯化胆碱）Riboflavin(VB2，376.4) 0.0489 2.445 4.890（核黄素）D-Biotin （VH，244.3） 0.10016 5.008 10.016（生物素）Folic Acid 0.0485 2.425 4.8

10、90（叶酸）（用氨水单独溶解，再加蒸馏水定容）Nicotinic Acid （123.11） 0.1994 9.97 19.94 （烟酸）Thiamine HCl （VB1，337.3） 0.47222 23.611 47.222 Ca-pantothenate （476.53） 0.1000 5.0 10.0（D-泛酸钙）Pyridoxine HCl （VB6，205.6） 0.1994 9.97 19.94（盐酸吡哆辛）C-fane cobalamin （VB12，1355.39） 0.000135 0.00675 0.0135P-Aminobenzoic acid (137.13) 0.

11、0494 2.47 4.94（对氨基苯甲酸）以上各种维生素除叶酸外均溶于水，叶酸需先用氨水单独溶解，再加蒸馏水。YEB培养基酵母提取物 1g/L蛋白胨 10g/L蔗糖 5g/LMgSO4·7H2O 0.5g/LPH 7.5YEP培养基酵母提取物 10g /L 胰蛋白胨 10g/LNaCl 5g/PH 7.0LB培养基胰化蛋白胨 10g/L酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L 琼脂粉 15g/LD-AS培养基NaFeEDTA 10ml/LN6 macro 50ml/LB5 micro 10ml/LDicomba(2,4-D) 1ml/LRTV 10ml/LCasamina aci

12、ds(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/L肌醇 100mg/LSucrose 20g/L葡萄糖 10g/LPH 5.8琼脂粉 8g/LAS(0.5M) 200lAgNO3 1ml/LAS和AgNO3 终浓度均为100M，且在培养基灭菌后稍凉时加入混匀。D-Cef培养基D-培养基+ 1ml/LAgNO3 + cef1ml/L D-Inf培养基N6 macro 50ml/LB5 micro 10ml/LRTV 10ml/LNaFeEDTA 10ml/LDicomba(2,4-D) 1ml/LCasamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/

13、L肌醇 100mg/L蔗糖 68.5g/L葡萄糖 36g/LPH 5.2菌液保存甘油占总体积的15%，120ml体系：60%甘油30ml，菌液90ml，液氮速冻后-70保存。 摇菌大肠杆菌：5mlLB培养基+50l菌液+5lKan，37，300rpm，12-16h农杆菌： 5mlLB培养基+50l菌液+5lSm+5lKan，28，330rpm，12-16h 抗性：质粒3301 KanpBI121 Amp农杆菌 SmpUC19 Amp 筛选后的恢复阶段1L培养基的组分6-BA 1.67ml （母液3mg/ml）NaFeEDTA 10ml/LN6 macro 50ml/LB5 micro 10ml

14、/LRTV 10ml/LDicomba(2,4-D) 1-2.5ml/LCasamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/L肌醇 100mg/L蔗糖 30g/LPH 5.8琼脂 8g/LCef 1ml黑暗培养2周诱导阶段恢复培养基中蔗糖50g/L，其他不变分化阶段恢复培养基中不加2,4-D和6-BA，其他不变，光照培养生根阶段1/2MS培养基MS基本培养基成分 分子量 使用浓度(mg/L)大量元素 20×（g/L） KNO3 101.11 1900 38NH4NO3 80.04 1650 33KH2PO4 136.09 170 3.4MgSO4.7

15、H2O 246.47 370 7.4CaCl2.2H2O 147.02 440 8.8微量元素 使用浓度(mg/L) 200×（g/L） KI 166.01 0.83 0.166H3BO3 61.83 6.2 1.24MnSO4·4H2O 223.01 22.3 4.46ZnSO4·7 H2O 287.54 8.6 1.72Na2MoO4·2 H2O 241.95 0.25 0.05CuSO4·5 H2O 249.68 0.025 0.005CoCl2·6H2O 237.93 0.025 0.005铁盐 使用浓度(mg/L) 200&

16、#215;（g/L）Na2·EDTA 372.25 37.3 7.46FeSO4·7H2O 278.03 27.8 5.56有机成分 使用浓度(mg/L) 200×（g/L）烟酸 0.5 0.1 盐酸吡哆醇VB6 0.5 0.1盐酸硫胺素VB1 0.1 0.02甘氨酸 2 0.4MS固体培养基 1LMS大量（20×） 50mlMS微量（200×） 5mlMS铁盐（200×） 5ml MS有机（200×） 5mlMS肌醇 0.1g蔗糖 30g琼脂 8gMS盐溶液MS大量MS微量铁盐6-BA： 用0.1mlNaOH溶解后，再用蒸

17、馏水定容。AS： 用DMSO溶解，并用蒸馏水定容。Dicamaba： 用无水乙醇溶解后，蒸馏水定容。Sm： 用水溶解，工作液浓度为125mg/L，储存液浓度为125mg/ml。接胚记录1、 CryAC-3301-ubi2、 CryIe-3301-ubi3、 ubi-CryAC-cab-CryIe-33014、ubi-signal-CryAC04、10、10 第四轮筛选结束04.10.11恢复04.10.26诱导1.2综3137皿×9=333个33皿30皿1.2综32皿×15=30个淘汰4综317皿×105皿3皿4综313皿×1010皿1皿3综313皿&#

18、215;102皿淘汰10月10号给1.2综31愈伤组织照相，作为论文资料。11月4号给1.2综31愈伤组织照相，作为论文资料。11月8号尽量淘汰所有生长不好的愈伤，将长的大的团块分成小块，11月13号再转入分化培养基中，光照培养，这次在诱导中生长了17天，我想让它长大些再转。11月9日，上午配2L分化培养基，配YEB培养基200ml，（一瓶固体，一瓶液体）11月13日，转入分化培养基，将大的团块夹碎，宫55皿（55×10块），这个阶段生长状况挺好，无污染。12月1日，在分化培养基上，根长的又快又猛，夺取养分，将根切除，转入新的分化培养基。12月3日，根很快长出，将其切除，、更新培养基

19、，将部分分化出的两片叶，又有茎的小苗转入（瓶子）生根培养基。12月5日，部分分化好的苗子转入生根培养基，至今已有60瓶，约100株，有的一瓶装1棵，有的2棵，最多的4棵。对分化苗的要求： 至少两片叶，有明显的茎才能转入生根培养基，切除根（此时的根是假跟，无活性），带部分愈伤刚转入分化培养基时，分化能力较强，应及时转入生根培养基，后期分化能力明显下降。发现： 将进入分化期的胚状体转入瓶子里（分化培养基）比转入皿中长得壮（叶墨绿茎粗），但分化不如在皿中的多，而且团块易渍死。炼苗： 打开封口膜，倒入一薄层自来水，原处放半天，再放到温室中1.5天，然后转入小盆中，（水不可浇太多，否则易淹死）对在分化期

20、有真菌污染的苗子，要尽快炼苗，转入土壤中生长。早期炼苗成活率高，后期死的较多。12月10日，炼苗何时的时期：根长三四根，比较壮（有三四根根时，在用水冲洗培养基时，可以避免因不小心将根弄断导致苗死的情况）营养土不必灭菌，移入的苗要小心冲洗干净其上面的培养基。下午将24瓶玉米苗转移至后面的大温室，炼苗。12月12日，将大温室的瓶子揭去封口膜（下午6:00），倒入一薄层水（防真菌），13号下午移入盆中。今明两天准备培养土。12月13日，上午将苗移入盆中，共48株移苗记录移栽棵树一周后存活的株数三周后存活的株数第一批12.13484747第二批12.21504646第三批12.25835150总计18

21、1144143以上各批炼苗均是先将瓶子移到后面的玻璃温室2-3天，以适应那里的环境，然后揭去封口膜，倒入一薄层水，再放置一天后，将苗子从瓶中移到盆中（移苗时，将根上的培养基洗净）待苗子在盆中返青，并长出至少2片新叶时，将盆中的营养土一并移入地中，浇透水移至大田记录棵数一周后的存活三周后存活第一批1.5737373第二批1.14716565总1月21日，给苗子松土，总共1行×7株+11行×11株+1行×10株=13行=138株补充实验记录接胚记录04.8.5 下午5:30（三天培养基）综31 11皿 约11×25=275综3 13

22、皿 约13×35=32504.8.8 晚上6:00转接7天培养基综31 17皿 约17×20=340综3 15皿 约15×20=30004.8.15 晚上转接14天第一轮筛选培养基中综31 14皿 综3 19皿 04.8.28 晚上转接第二轮筛选培养基中04.9.11 晚上转接第三轮筛选培养基中菌没有摇好，胚从下午5:30放到凌晨1:00，放的太久了04.8.7 早晨3:00 （三天培养基） 综31 15皿 约15×50=2751.2综31 4皿 约13×35=3251.2综3 14皿 约13×35=325 生长差，后来淘汰很多04.8.9 晚上转接7天培养基综31 11皿 约11×30=33004.8.10 上午转接1.2综31 8皿 约8×25=2001.2综3 3皿 约3×18=5404.8.16 晚上转接14天第一轮筛选培养基中综31 13皿 1.2综31 3皿 1.2综3 2皿 04.8.30 晚上转接第二轮筛选培养基中04.8.9 晚上11:00