超氧化物歧化酶(SOD)的生产技术(共29页).ppt

1、工程四工程四:超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的生产的生产任务一：任务一：SOD制备方案的制定制备方案的制定生药1121 第五组 2021423242杨恪鉴一一.SOD的概况二.SOD的运用三.SOD的生产四.SOD的活力测定 1.SOD的概念 超氧物歧化酶Superoxide Dismutase简称SOD是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健

2、康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。 根本原理 SOD属于金属蛋白酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶 Cu-ZnSOD 、含锰超氧化物歧化酶 Mn-SOD 和含铁超氧化物歧化酶Fe-SOD 。三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基，将之歧化为过氧化氢与氧气。 在细胞由于自由基非常活泼，化学反响性极强，参与一系列的连锁反响，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。 4

3、 4.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光谱特性 3.3 SOD稳定性及影响因素 它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反响， 即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反响， 从而去除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2， 在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。 超氧化物歧化酶SOD的催化底物是O2 ，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。 常用的有： 邻苯三

4、酚自氧化法 细胞色素C复原法McCord法 化学发光法 免疫学方法 电泳法 长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。 CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右， 这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时， CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。 SOD对热的稳定性与

5、溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95, 其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用1.药物SOD是一种新型的抗炎症药， 根据SOD作用机制和毒性试验 ，它对治疗因O2-引起的各种 疾病都有一定的疗效。为此， SOD可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌堵塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。 2.添加剂 国外不少高级化装品都添加SOD， 国内也有

6、数家工厂或公司在开发和生产SOD化装品， 如大宝SOD密，康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD作为化装品添加剂主要有3个优点： 1有明显的防晒效果 2可防皮肤衰老，阻止紫褐质老年斑的形成 3有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。 国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨SOD饮料。SOD及修饰过的SOD还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂 3. 生化试剂 国外已有数家公司如Sigma公司等出售SOD试剂，国内也有厂家批量生产SOD试剂， 如中科院上海生化所东风试剂厂、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作为某些疾病的探针， 如郭彦等人认为

7、脑瘤组织线粒体Mn-SOD降低是转化细胞的可靠生化指标之一， 并可作为评估脑瘤分化程度的参考。 综上所述，随着人们对SOD更广泛深入的研究，不同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。 1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，参加石英砂研磨破碎细胞后，参加pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液pH7.815ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。 2.去除杂蛋白 上清液中参加0.25倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min

8、，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液 3.SOD酶的沉淀别离 粗酶液在搅拌下缓慢参加固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀 4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。 5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量 6.将浓缩冷冻枯燥后即得成品。 原理 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产

9、物在325nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。 仪器 紫外分光光度计、pH计,离心机 试剂 0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml pH=8.3 Tris-HCl缓冲溶液 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷Tris溶液: NH2C(CH2OH)3 121.14 取12.114g,溶解，定容至100ml 0.1mol/L盐酸: 取8.6(9)ml浓盐酸，稀释至1000ml 5 0毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷Tris溶液 19.9_毫升0.1

10、mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。 (保存温度: 常温密封避光保存) 酶液的制备 称取6g样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min 离心20min,取上清液用于酶活测定。 连苯三酚自氧化速率的测定 取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,参加10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min, 参加10 缓冲液，迅速摇匀 倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次 计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min 酶活测定 测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同， 取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,参加3ml酶液，参加10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min, 参加3ml酶液，参加10 缓冲液，迅速摇匀 计算加酶后连苯三酚自氧化速率 样品酶活单位表示，SOD酶活单位U/g鲜重 样品酶活单位= 式中酶样品在325nm处每分钟光密度变化值 V反响液体积 n酶液稀释倍数假设酶液足够多，可不稀释即n为1 1.SOD的平安性 大量试验和临床