152_GLP-1受体激动的高通量筛选及作用机制研究

1、GLP-1受体激动的高通量筛选及作用机制研究殷菲，郑旭煦，景佳佳，肖何，刘建辉*(重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心，重庆，400067)*, 刘建辉，男，副教授，硕士研究生导师 Tel/Fax eamil: 摘要：目的 筛选GLP-1受体激动剂，并进行初步的作用机制研究。方法 建立稳定的GLP-1受体激动剂高通量筛选模型，从天然药物中筛选活性成分；在PC12细胞中验证GLP-1受体激动剂的功能及作用机制。结果 经过筛选、鉴定，京尼平苷是一种新的GLP-1受体激动剂，能够通过MAPK信号通路诱导PC12细胞分化，对抗过氧化氢诱导的P

2、C12细胞氧化损伤，提高神经细胞活力。结论 京尼平苷具有与GLP-1受体激动剂类似的神经营养和神经保护功能。关键词：胰高血糖素样肽1(GLP-1)；激动剂；京尼平苷Screening of Agonist for Glucagon-Like Peptide-1 Receptor and its Effect in PC12 cellsYin Fei, Zheng Xuxu, Jing Jiajia, Xiao He, Liu Jianhui(Research Center of Pharmaceutical Chemistry & Chemical Biology, Chongqing

3、 Technology and Business University, Chongqing, 400067, China)ABSTRACT：OBJECTIVE To acquire the agonist for glucagon-like peptide-1 receptor, and check its function. METHODS Natural products are collected to screen in the stable cell line of GLP-1 receptor, and the active component was identified in

4、 the PC12 cells. RESULTS Geniposide is a novel agonist for GLP-1 receptor, which induces the neuronal differentiation of PC12 cells via mitogen-activated protein kinase pathway, and prevents PC12 cells from oxidative damage induced by hydrogen peroxide. CONCLUSION Geniposide has the similar function

5、 with the agonist for GLP-1 receptor, including neurotrophic and neuroprotective effects.KEY WORDS：Glucagon-like peptide-1; Agonist; Geniposide1 前言随着人类平均寿命的增长，人口老龄化问题日益突出，Alzheimer病(Alzheimer's disease，AD)的发病率越来越高。尽管人们目前对AD产生的原因和发病机制还不十分清楚，但是，氧化应激以及细胞抗氧化功能的失衡在AD的发病机制中有重要的作用1-2；环境或基因突变导致淀粉样前体蛋白(-

6、amyloid precursor protein，APP)代谢异常，在神经元细胞外产生具有兴奋毒性的-淀粉样蛋白(-amyloid protein，A)是形成AD的重要机制之一3。因此，筛选和发现一些能够对抗氧化应激、提高细胞抗氧化能力的药物对于治疗和预防AD具有重要意义。Perry等研究发现，胰高血糖素样肽1(glucagon like peptide-1，GLP-1)及其受体激动剂exendin-4具有神经营养和神经保护作用，能够诱导PC12细胞分化、对抗多种因素引起的神经元氧化损伤4-9。我们应用以Luciferase为报告基因的GLP-1受体激动剂高通量筛选(high through

7、put screen)模型，发现传统中药栀子提取物中存在GLP-1受体激动剂，经过初步分离和与标准品对照证实，京尼平苷(geniposide)能够激活GLP-1受体。在此基础上，我们进一步在大鼠嗜铬神经瘤PC12细胞中研究发现，京尼平苷不仅能够通过激活有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径诱导PC12细胞分化，而且还能够对抗H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高细胞存活率。2 材料与方法2.1 实验材料PC12和HEK293细胞购自中科院上海细胞库；胎牛血清、马血清、DMEM购自Hyclone

8、公司；MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)购自Amersco公司；京尼平苷购自Wako公司；U0126、p-MAPK、MAPK、-actin、GAP-43、Bcl-2、Bax等一抗以及HRP标记的抗鼠、抗兔二抗都购自Cell signaling technology公司；LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen；ECL advance购自Amersham；PVDF膜购自Millipore公司；GLP-1(7-36)、G418购自Calbiochem公司；Brightgl

9、o购自Promega公司；GLP-1受体和报告基因质粒由华东师范大学胡应和教授赠送。2.2 GLP-1受体激动剂的高通量筛选 GLP-1受体激动剂高通量筛选细胞株的建立方法与我们以前报道的方法相似10。将野生型293细胞接种于6孔板，细胞密度为0.5-1 × 105个/ml，将GLP-1R和报告基因质粒按1:5的比例用Lipofectamine 2000转染到贴壁的HEK293细胞中。转染细胞用800 g/ml的G418筛选，挑取单克隆，扩大培养后，用Forsklin和GLP-1激活细胞株，加药后继续培养6-8小时，加入Luciferase底物Brightglo，用Viretas检测

10、荧光素酶的活力。2.3 细胞活力测定本文采用MTT法测定京尼平苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。在各种处理的PC12细胞中加入MTT溶液，使其终浓度达到0.5 mg/mL 37下孵育2-4小时。终止孵育后，吸去上清，加入DMSO(pH 4.7)，溶解活细胞中的甲臜颗粒。用酶标仪在570 nm波长下测定光密度值OD570，参考波长为630nm(吸光值表示为OD630)。2.4 京尼平苷诱导PC12细胞分化将PC12细胞接种到含5胎牛血清、10马血清的DMEM中培养，待细胞贴壁以后，培养基更换为测试培养基(1胎牛血清、2马血清的DMEM)，加入京尼平苷或NGF。继续培养4天以后，在

11、显微镜下分析细胞突触的延伸情况，统计有突触的细胞比例和突触长度。2.5 Western blot收集各种处理的PC12细胞，裂解后用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，以20 g总蛋白上样，10丙烯酰胺电泳后转移到PVDF膜上，用含5脱脂奶粉的TBST室温封闭1小时(TBST：20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5，0.5 Tween 20)；随后用一抗孵育2小时，一抗稀释比例为1:5000-1:10000，用TBST洗三次，每次15分钟；接着用1:12000的HRP标记二抗孵育1小时，TBST洗三次，每次15分钟；用ECL advance孵育结合抗体5分钟，在暗室中压片；最

12、后用Quanty one分析目标蛋白的变化，实验以-actin为内参。2.6 数据分析 所有实验数据用Origin 7.0进行分析，P<0.05被认为有显著差异，数据表示方式是平均值±标准偏差，数据分析方法为t检验. 3 结果3.1 GLP-1受体激动剂的高通量筛选我们对400多种中药样品进行了筛选，结果发现中药栀子中存在能够激活GLP-1受体的活性成分，经过初步分离和与京尼平苷标注品对照，发现京尼平苷是其中的活性成分。如图1所示，京尼平苷可以激活GLP-1受体，诱导GLP-1受体细胞株中Luciferase的表达，表明京尼平苷是一种GLP-1受体激动剂。图1 京尼平苷激活GL

13、P-1受体.Fig. 1 Basal and induced levels of luciferase expression in HEK293 cells which were co-transfected with human GLP-1 receptor and luciferase reporter genes. The results represent at least three independent experiments and are expressed as means ± SD. (*, p<0.01 Vs control; #, p<0.1 V

14、s Forsklin alone, N = 6) 3.2 京尼平苷诱导PC12细胞分化 Control NGF(100 g/l) Geniposide (50 mg/l) U0126(10 M)+Geniposide (50 mg/l) 在做细胞突触伸长分析时，PC12细胞以2×104个/ml接种到预先涂有多聚赖氨酸的6孔板中，待细胞贴壁以后，培养基更换为DMEM补加1胎牛血清、2马血清的测试培养基中。随后加入NGF和不同浓度的京尼平苷培养细胞4天，在显微镜下观察到，NGF和京尼平苷能够诱导PC12细胞分化，细胞延伸大量突起，表现出神经样分化特征(图2B、2C)，但是，在对照孔中很少

15、有细胞延伸突起(Fig 2A)。为了统计京尼平苷诱导的PC12细胞延伸突起的比例，我们以突触长度超过1.5倍胞体直径为标准对细胞突起的长度进行计算和统计，结果发现，50 mg/l的京尼平苷能够使超过60的细胞延伸突触，结果如图3所示。图2 京尼平苷诱导PC12细胞神经样分化.Fig.2 Micrographs showing the outgrowth of neurites from PC12 cells in response to geniposide or NGF. 图3 京尼平苷提高PC12细胞中延伸突触的细胞比例.Fig. 3 Geniposide increase the per

16、centage of neurite-bearing cells in a dose-dependent manner. The results represent at least three independent experiments and are expressed as means ± SD. (N = 3, *P < 0.05 versus control.)3.3 京尼平苷对PC12细胞中GAP-43表达的影响 由于GAP-43在调节神经元突触延伸过程中具有十分重要的作用，是神经细胞分化的一个重要特征，我们也分析了京尼平苷对PC12细胞中GAP-43表达的影响

17、。在用京尼平苷作用PC12细胞4天后，收集处理后的细胞，Western blot方法分析京尼平苷对GAP-43表达的影响，实验结果发现，京尼平苷可剂量依赖的提高PC12细胞中的GAP-43蛋白水平(图4)。Geniposide (mg/l)0 5 10 20 50 100GAP-43-actin图4 京尼平苷调节PC12细胞中GAP-43表达.Fig 4. Immunodetection of GAP-43 and -actin proteins from PC12 cell lysates after treatment with geniposide.3.4 京尼平苷对PC12细胞中MAP

18、K磷酸化的影响 有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)在调节细胞生长、分化以及存活的过程中都有重要的作用。为了考察京尼平苷诱导PC12细胞分化的细胞信号转导途径，在预先用MEK抑制剂U0126作用PC12细胞30分钟后，向细胞中加入京尼平苷或NGF，继续培养5分钟后，收集细胞，用western blot方法分析MAPK的磷酸化情况。结果发现，京尼平苷能增强MAPK磷酸化，但是对MAPK的表达没有明显影响；同时，MEK抑制剂U0126能显著地抑制京尼平苷诱导的MAPK磷酸化，表明京尼平苷诱导的PC12细胞分化与MAPK信号通路有关

19、。结果如图5所示。图5. Gen(mg/l) - - + - +NGF(g/l) - - - + -U0126(M) - + - - +P-MAPK44P-MAPK42MAPK44MAPK42AB京尼平苷诱导MAPK磷酸化.Fig 5. Geniposide induces PC12 cells differentiation via the MAP kinase pathway.3.5京尼平苷对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用MTT实验结果表明，在0-100 mg/l范围内京尼平苷对PC12细胞的活力没有明显的影响(图6)，表明在此浓度下的京尼平苷没有细胞毒性。同时，过氧化氢能够

20、剂量依赖的降低PC12细胞的活力，结果如图7所示。我们还研究发现，在过氧化氢处理前2小时入50 mg/l的京尼平苷，可提高细胞活力约40(图8)。表明京尼平苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤有保护作用。为了进一步研究京尼平苷保护PC12细胞避免氧化损伤的作用机制，我们对京尼平苷处理的PC12细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的水平进行了分析，实验结果表明，京尼平苷可以显著提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，抑制促凋亡蛋白Bax的表达(Fig. 9)。上述研究结果提示，京尼平苷可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2水平抑制H2O2诱导的PC12氧化损伤，提高细胞活力。图6 京尼平苷对PC12

21、细胞活力的影响.Fig 6. Effects of geniposide on the PC12 cells viability. After PC12 cells were treated with geniposide at indicated dose for 24 h, cells viability was determined with MTT assay. The data are expressed as mean ± SD of five separate experimental values performed in triplicate. 图7 H2O2诱导P

22、C12细胞氧化损伤.Fig 7. Hydrogen peroxide decreases PC12 cells activity in a dose-dependent manner. The values are mean ± SD from four independent experiments, *,P<0.05; *, P<0.01 Vs Control(PBS at equal volume).图8. 京尼平苷对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用.Fig 8. Geniposide protects PC12 cells from oxidative

23、 damage induced by hydrogen peroxide. All the data are mean ± SD of four independent experiments. *, P<0.05; *P<0.01 Vs Negative control (500M H2O2 alone).图9 京尼平苷调节Bcl-2 和Bax蛋白表达.Fig. 9 Geniposide antagonists the H2O2 induced PC12 cells oxidative injury by increasing the antiapoptotic pro

24、tein Bcl-2 expression and decreasing the apoptotic protein Bax levels.4 讨论 本文利用GLP-1受体激动剂的高通量筛选模型，筛选并证实京尼平苷是一种新的GLP-1受体激动剂，具有与GLP-1及其激动剂exendin-4类似的功能，能够诱导PC12细胞神经样分化，提高神经元信号分子GAP-43表达；由于MEK抑制剂U0126能够抑制京尼平苷诱导的PC12细胞神经样分化，减少有突触的细胞比例，抑制京尼平苷诱导的PC12细胞中MAPK磷酸化，因此，京尼平苷诱导的PC12细胞分化与MAPK信号通路有关。同时，我们还研究发现，京尼平

25、苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤有保护作用，能够通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，减少氧化应激诱导的PC12细胞氧化损伤，显示出神经保护功能。京尼平苷是中药栀子的主要活性成分，除了清肝利胆、抗肿瘤的功能外，也有关于京尼平苷抗氧化、抗炎的报道11。左明雪等12研究发现，京尼平苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达有明显的影响，能明显提高GSH-Px表达，上调钙结合蛋白，这说明京尼平苷对缺血性脑神经损伤中的自由基损伤具有很好的拮抗作用。赵新民等13研究证实，京尼平苷对二甲苯所致小鼠耳廓及角叉菜胶所致大鼠足跖炎症均有不同程度的抑制作用，显示出较好的抗炎活性。韩国的Park等14发现，栀子乙醇提取物

26、及其主要活性成分京尼平苷、京尼平(Genipin)都有一定的抗炎作用。台湾的Wang等15研究认为，栀子中的京尼平苷不仅具有戒毒、抗氧化、抗肿瘤作用，而且还能通过Ras/Raf/MEK-1/MAPK激酶途径诱导谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)M1和M2亚基的表达促进肝细胞解毒。Lee等16在大鼠海马切片中研究证实，京尼平苷能够减少氧和葡萄糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation)引起的氧化损伤，增强海马神经元的抗氧化能力。由于PC12细胞中存在GLP-1受体4，京尼平苷可能通过激活GLP-1受体发挥其神经营养和神经保护作用。尽管

27、京尼平苷保护H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的作用机制及其细胞内的信号转导途径还有待进一步研究，但是，现有的实验结果表明，京尼平苷具有神经营养和神经保护作用，对PC12细胞的氧化损伤有一定的保护作用，提示它在抗衰老和治疗氧化损伤引起的神经退行性疾病方面可能具有一定的价值。致谢本项目得到国家自然科学基金(3000813)和重庆市科委重点基础项目资助(CSTC, 2004BA5015)，我们也非常感谢华东师范大学胡应和教授提供了GLP-1R和报告基因质粒，同时感谢他在项目设计以及研究工作中提出的诸多建设性意见和建议。参考文献(1) Akwa Y, Allain H, Bentue-Ferrer

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