肿瘤学的一些概念_百度文库

1、micro RNA同义词microRNA一般指micro RNAMicroRNA (miRNA 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有28645 个miRNA 分子(Release 21: June 2014 。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster 的形式存在于基因组中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001 。简介MicroRNA (miRNA 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内

2、具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 基因是位于TUs区( transcription micro RNAmicro RNA units , TUs ( Rodriguez et al ,2004 , 且其中大部分是位于内含子区( Kim &Nam , 2006 。一些内含子miRNA 基因的位置在不同的物种中是高度保守的

3、。miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001 。miRNA 高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。MicroRNAMicroRNA(miRNA是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,几个miRNAs 也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。Mic

4、roRNA存在多种形式,最原始的是pri-miRNA,长度大约为3001000个碱基; pri-miRNA经过一次加工后,成为pre-miRNA即microRNA前体,长度大约为7090个碱基;pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后,成为长约2024nt的成熟miRNA。实际研究中,pre-miRNA应用最早,也最广泛,很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来,研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用,所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。MicroRNAs (miRNAs是一种大小约2123个碱基的单链小分子RN

5、A,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链但是和siRNA密切相关。据推测,这些非编码小分子RNA(miRNAs参与调控基因表达,但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7,随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。特征已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构,约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的,有5端磷酸基和3羟基,大小约2125nt 的小分子RNA片断,定位于RNA前体

6、的3端或者5端。3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中,有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性(只有有12个碱基的区别。Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为:所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物(Ortholog,指那些起源于同一祖先,在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类,这些类似的基因被称为“直向同源物”。Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子micro RNA micro RNA 的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长,而由转座子

7、介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较,发现一段90bp的高度保守区,经过RNA folding program (mfold发现这个保守序列可以形成发夹结构,使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ,用这个90bp的mRNA前体经过一

8、系列的“功能缺失”“功能恢复”实验,证实bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hid mRNA的3非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点(hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因,并证实bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达,而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern在不同组织、不同发育阶段中miRNA 的水平有显著差异。功能科

9、学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫,果蝇,小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异,这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性(differential spatial and temporal expression patterns,提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子,因而具有重要意义。第一个被确认的miRNA在线虫中首次发现的lin-4和let-7,可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3非编码区(3UTRs,以一种未知方式

10、诱发蛋白质翻译抑制,进而抑制蛋白质合成,通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002。bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7,已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控,例如mir-14、mir-23 等。在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpel factory (car 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶,参与植物

11、的发育,其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。对一部分miRNAs的研究分析提示:miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育(Reinhart 2000,细胞增殖,细胞凋亡,细胞死亡(Brennecke 2003,脂肪代谢(Xu 2003和细胞分化(Kawasaki 2003。此外,一个研究表明,2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关,提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002。由于miRNAs存

12、在的广泛性和多样性,提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段,据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是:miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。然而,大多数miRNAs的功能仍然是个谜。MicroRNA的过表达MicroRNA存在多种形式,最原始的是pri-miRNA ,长度大约为300-1000个碱基pri-miRNA经过一次加工后,成为pre-miRNA 即microRNA前体,长度大约为70-90个碱基;pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后,成为长约20-24nt的成熟

13、miRNA 。实际研究中,pre-miRNA应用最早,也最广泛,目前很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来,研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用,所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。MicroRNA的下调赢润生物可以提供化学合成的miRNA inhibitors ,用于下调目的细胞中的miRNA ,以实现loss-of function研究。如果您需要进行长期、稳定的miRNA下调,则可以选用赢润生物构建的载体形式的miRNA inhibitor。其转染效率高,下调效果好,可以实现对目的miRNA的长期、稳定的

14、下调。赢润生物载体形式的miRNA inhibitor,采用的是miRNA sponge法,这也是目前SCI文献中用的较多的一种方法。作用方式microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用一直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度,有三种方式。第一种是切断靶基因的mRNA分子miRNA与靶基因完全互补结合,作用方式和功能与siRNA非常相似,最后切割靶mRNA。在植物中,大部分miRNA都以这种方式,靶基因mRNA断裂后,无poly(A的分子的3端加上多个U并很快降解,含poly(A的分子能稳定存在一段时间(如拟南芥miR-171。在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补

15、(这些scarecrow 基因编码潜在的转录因子,尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶,这仍是第一次发现miRNA 和其潜在的目标靶完全互补,也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。第二种是抑制靶基因的翻译作用时与靶基因不完全互补结合,进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性,这种miRNA是目前发现最多的种类(如线虫lin-4。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。第三种是结合抑制具有以上两种作用模式:当与靶基因互补结合时,直接靶向切割mRNA;当与靶基因不完全结合时,起调节基因表达的作用。1识别方法多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对miRN

16、As的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的,2123个碱基大小、有5端磷酸基和3羟基的RNA片断,有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子筛选一定大小的RNA分子,连接到3和5的适配子(adapters,逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。有的实验室通过一种RNA folding program mfold来判断C. elegans 和C. briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体

17、,然后用Northern Blots的方法来确定这些miRNAs是否真的表达了。尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来,已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟,由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的,所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了,测序工作还远远不够。siRNAmiRNA和siRNA之间的关系令人迷惑。从表面上说,一个是非编码的单链小分子RNA,在进化上高度保守,通过翻译抑制调控基因表达;另一个是针对编码区的双链小分子RNA,每个转录本都可能有很多个siRNAs,是通过降解目标靶,在转录后调控基因表达。由于每个m

18、RNA模版可能产生很多个siRNAs,要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的,因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能,而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。然而,据推测miRNAs通常是由较大的(70­90 nt的茎环结构(发夹结构前体经Dicer 酶切割得到的,而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA,而且二者的长度也差不多,同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。两个广为人知的miRNA在线虫中首次发现的lin-4 和let-7,通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从

19、而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解,就是说作为翻译抑制子本身不影响对应mRNA的丰度,其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以类似siRNA的方式介导目的RNA的降解。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA 会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA,包括在植物中发现的Scarecrow miRNA,能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列,抑制蛋白合成。这提示miRNAs 可以和siRNAs一样作用,这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。这种重叠

20、同样提示siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。一个很有趣的实验证实这个观点:Doench和同事挑选一个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA,然后在荧光素酶报告基因的3端插入对应的CXCR4结合位点其中一个拷贝是插入一个完全匹配的CXCR4结合位点,另一个拷贝插入4个只有3和5端匹配,而中间不同的CXCR4结合位点,这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入Hela细胞并用siRNA诱导基因沉默。结果很有趣两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过10倍,RT-PCR和Northern分析证实,第一个实验的荧光素酶转录本下降了超

21、过10倍,这正是正常的siRNA 介导的RNAi反应,目标靶mRNA降解导致表达水平的下降,而第二个实验中荧光素酶转录本仅仅下降1.2倍,这种目的基因表达水平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降,而不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明:siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。实验人员还进行了另一个实验:改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果,但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好,增加siRNA的量,抑制效果越好这一点和siRNA抑制的情况一样唯一不同的是:完全匹配的结合位点(siRNA作用方式可以单独起作用而相互不影响,

22、而增加不完全配对的结合位点(注意在第二个实验中用了4个CXCR4结合位点的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA,外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中,从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA,甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。待解决问题miRNAs在多个物种中广泛被发现,而且在进化上高度保守。这些“小玩意儿”留给我们一大堆谜团:miRNA的确切功能是什么?它的目标靶是什么?作用机制是什么?也许

23、需要对植物或者线虫的基因组进行miRNAs突变株的筛选,在果蝇中可以用targeted-disruption 缺失miRNA序列。对miRNA突变株伴随的表型缺失进行研究,有助于解释miRNAs的功能。正如Phillip Zamore说的:“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能,那真是大自然拿科研人员开涮而且是一个残酷的玩笑”。研究工具随着小分子RNA日益受到研究人员的重视,很多研究小分子RNA的新方法不断推出。分离由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程,在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同,进一步了解小分子RNA的生物功能需要确定其在各种

24、生物样品中的表达水平,因而需要一种精确的定量纯化方法,从而得到可信的数据。现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀,或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200nt以上,小分子RNA往往被淘汰掉,因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA,但是后继的沉淀步骤比较费时费力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter,GFF,既能够有效富集10mer以上的RNA分子,又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点,是一个不错的选择。对于特

25、别稀有的分子,由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度,还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高灵敏度。探针制备方法其实很简单:只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列,3端另外增加8个和T7启动子互补的碱基,将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火,用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版,然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合,体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记(同位素、非放射性标记均可的小于100nt 的小分子RNA探针,适用于包括RPAs,Northerns 和原位杂交等各种方法检测小分子核仁RNA( small nuclear

26、RNA,snRNA,small interfering RNA (siRNA,micro RNA (miRNA和mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。检测由于小分子RNA是一类很小的分子,部分小分子RNA表达水平可能很低,因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小,用RT-PCR的方法来定量研究非常困难,多数研究人员采用Northern Blots一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物(膜上的目标分子,由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏,生物

27、通在这里为大家推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交,未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化,然后使核酸酶失活,并纯化杂交的RNA分子,最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。这个基于液相杂交的新方法不但操作简单而快速,而且灵敏度极高可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA,或者说,可以检测attomole (10-18 mol级别的靶目标!灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外,研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长的RNA模版。应该说,这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人

28、员带来不少方便。总而言之,无论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的小东西,小分子RNA研究的不断深入将帮助我们揭示更多生命的奥秘。功能分析miRNA 的上调可用于鉴定功能获得表型;抑制或下调可以研究功能缺失表型。MicroRNA功能分析上调与下调的结合可用于鉴定被特定miRNA 调节的基因,以及特定miRNA 参与的细胞进程。主应用包括:miRNA 靶定位点的鉴定和验证筛选调节某个特定基因表达的miRNAs筛选影响某个特定细胞进程的miRNAsmiRNA展望miRNA在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用,越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进

29、一步的深入研究,以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究,将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记,还可能使得这一分子成为药靶,或是模拟这一分子进行新药研发,这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。第二代DNA测序技术第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis,即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和A

30、pplied Biosystems SOLID system。概述术的基本原理、操作流程等方面。基本原理Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。操作流程1测序文库的构建(Library Construction首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome Analyzer 系统所需的

31、样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中,然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头(Adaptor。如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size对于后面的数据分析有影响,可根据需要来选择。对于基因组测序来说,通常会选择几种不同的insert size,以便在组装(Assembly的时候获得更多的信息。2锚定桥接(Surface Attachment and Bridge AmplificationSolexa测序的反应

32、在叫做flow cell的玻璃管中进行,flow cell又被细分成8个Lane,每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。3预扩增(Denaturation and Complete Amplification添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增,单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性,释放出互补的单链,锚定到附近的固相表面。通过不断循环,将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4单碱基延伸测序(Single B

33、ase Extension and Sequencing在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,在每一个测序簇延伸互补链时,每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling,Illumina公司Base Calling所用的软件是Illuminas Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis So

34、ftware。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加,错误率也会随之上升。5数据分析(Data Analyzing这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分,但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列,要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架,或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上,并进一步分析得到有生物学意义的结果。正义链DNA上有编码蛋白质氨基酸序列相反链核苷酸序列与正义链互补存在于:DNA或RNA结构1、DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序

35、列的链称为正义链,又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补,称为反义链。反义基因是指与细胞内DNA或RNA序列相互补形成杂交体而阻断或减弱其转录和翻译过程的DNA或RNA片段。2、(二作用机制:两条互补的DNA链其中一条携带编码蛋白质信息,称为正义链,另一条与之互补的称为反义链。3、1.反义核酸技术:DNA或RNA结构中含编码序列的链被称为正义链,与之相配对的链则叫做反义链。反义核酸(RNA和DNA是和它们的靶基因相互补的。4、siRNA双链中和信使RNA(mRNA的靶向序列相同的链称为正义链,与之互补的另一条链为反义链。siRNA包括5-磷酸末端、19nt的双链区、3-羟基末端和2个不配对

36、的3端核苷酸突起,可指导mRNA的裂解。反义链基因的DNA双链中,转录时作为mRNA合成模板的那条单链叫做模板链或反义链(template or antisense strand。概念反义链和有义链(sense strand在以前的概念和现今的使用之间存在有一些混乱,从概念上说在基因的DNA双链中,转录时作为mRNA合成模板的那条单链叫做模板链或反义链(template or antisense strand,而转录时不能作为mRNA合成模板的那条单链叫有义链,但为了使用上的方便,现今通常将mRNA看作是有义分子(sense molecule而将与mRNA 序列一致的DNA单链(假定DNA中的

37、T替代mRNA的U标为有义链,在文献中,这条与mRNA序列一致的DNA单链序列被用作基因序列。该序列的5端称之为上游(upstream 3端称之为下游(downstream。发现过程1961年,韦斯(Weiss等发现立体系统的双链的DNA都可以作为模板,合成不同的RNA分子。马默(Marmur在侵染枯草杆菌的实验中发现,DNA分子两条链中只有一条具有转录功能,这条具有转录功能的链叫做模板链或反义链,另一条无转录功能的链叫做编码链或有义链。应该指出的是:在一条包含有若干基因的DNA分子中,各个基因的有义链,并不一定都在同一链上,也就是说,他们各自具有自己的有义链,即有的基因的有义链是3'

38、5'单链,有的基因的有义链则是5'3'单链。所以也可以说DNA分子双链中的一条链对某些基因来说是有义链,而对另一些基因来说则是反义链。siRNAsiRNA (Small interfering RNA,是一种小RNA分子(21-25核苷酸,由Dicer(RNAase 家族中对双链RNA具有特异性的酶加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。发现RNA干扰现象是1990年由约根森(Jorgensen研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现,为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶,结果意外得到了白色和白紫杂色的矮

39、牵牛花,并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。1992年,罗马诺(Romano和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995年,Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。1998年,安德鲁·法厄(Andrew Z. Fire等在秀丽隐杆线虫(C.elegans中进行反义RNA抑制实验时发现,作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果。从与靶mRNA的分子量比考虑,加入的

40、双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果,因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。2006年,安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C. Mello由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。原理RNA干涉(RNAi在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA (dsRNA诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必

41、需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer(Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域:Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区结合,形成酶-dsRNA复合体。Dicer 切割后形成siRNA,然后,在A TP的参与下,细胞中存在的一种R

42、NA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。特点siRNA有如下特点:1. 长度约在22nt左右。2. 依赖Dic

43、er酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点。3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。4. 是RISC组分。5. siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。6. siRNA一般是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物;植物体内也存在内源的siRNA。7. 结构上,siRNA是双链RNA。8. 在Dicer酶的加工过程中,siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。9. 在作用位置上,siRNA可作用于mRNA的任何部位,并与mRNA完全互补。10. 在作用方式上,siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。11. siRNA不参

44、与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。设计问题关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响,还没有可靠的规律。虽然可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置,但这个过程十分耗时且昂贵,不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3-4对siRNAs,实验选择较有效的siRNA。siRNA设计大都根据Tuschl的实验,要点如下:1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始,寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。(用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA。设计siRNA时

45、不要针对5和3端的非编码区。2.分析获得的序列,选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。3.将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等进行比较,排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。4.如果选择shRNA,有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。下面是另一个设计的版本,大致相同:1. 从转录本(mRNA的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区(un

46、translated regions,UTRs,原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA的效果。2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST3. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。负对照一个完整的siRNA实验应该有负对照,作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的

47、siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。如果计划合成siRNA,那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列,厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA 是以3dTdT结尾,如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示,UU结尾和dTdT 结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。现在Qiagen公司的网站上有完整的siRNA 的设计方法,可以自动设计并生成多个备选序列,并且可以自动连接到基因组数据库进行检索比对。制备体外制备1.化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别

48、是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素2.体外转录以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得

49、一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法

50、制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA 转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响

51、。最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗体内表达前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs 转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA 模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。4. siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA在哺乳动物细胞中的表达。这三

52、类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研

53、究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作。5. siRNA表达框架siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PC

54、R得到,不用一天的时间。因此,SECs 成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了转录因子转录

55、因子(Transcription factors ,TFs。真核生物转录起始十分复杂,往往需要多种蛋白因子的协助,转录因子与RNA聚合酶形成转录起始复合体,共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类;第一类为普遍转录因子,它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合体时,转录才能在正确的位置开始。除TFD以外,还发现TFA,TFF,TFE,TFH等,它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子,这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素生长因子或其它刺激后,开始表达某些特异蛋白质分子时,才需要的一类转录因子。简介RNA的转录合成从化学角度来讲类

56、似于DNA的复制,多核苷酸链的合成都是以53的方向,在3-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键,但是,由于复制和转录的目的不同,转录又具有其特点:(1对于一个基因组来说,转录只发生在一部分基因,而且每个基因的转录都受到相对独立的控制(图17-2;(2转录是不对称的。(3转录时不需要引物,而且RNA链的合成是连续的。RNA转录过程定义转录因子(transcription factor是一群能与基因5端上游特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。人类金属硫基因调节区人类金属硫基因调节区结合位点转录因子的结合位点(transcription factor bi

57、nding site,TFBS是转录因子调节基因表达时,与基因模板链结合的区域。按照常识,转录因子(transcription factor,TF的结合位点一般应该分布在基因的前端,但是,新的研究发现,人21和22号染色体上,只有22%的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端。分类真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录机构的一部分往往是通过体外系统看它是否是转录起始所必须的。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类:亚基RNA聚合酶的亚基,它们是转录必须的,但并不对某一启动子有特异性。复合物某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物,但不组成游离聚合酶

58、的成分。这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的,但亦可能仅是譬如说转录终止所必须的。但是,在这一类因子中,要严格区分开哪些是RNA聚合酶的亚基,哪些仅是辅助因子,是很困难的。特异顺序某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。如果这些顺序存在于启动子中,则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些种类的启动子中,则识别这些顺序的因子也只是在这些特异启动子上起始转录必须的。黑腹果蝇的RNA聚合酶需要至少两个转录因子方能在体外起始转录。其中一个是B因子,它与含TATA盒的部位结合。人的因子TFD亦和类似的部位结合。同样,CTF(CAA T 结合因子则与腺病毒的主要晚期启动子中与CAA T盒同源的部位相结合。结合在上游区的另一个转录因子是USF(亦称MLTF,则可以识别腺病毒晚期启动子中靠近-55的顺序。转录因子Sp1则能和GC盒相结合。在SC40启动子中有多个GC盒,位于-70到-110之间。它们均能和Sp1相结合。然而含有GC盒的不同的DNA顺序与Sp1的亲和力却各不相同。可见GC盒两侧的顺序对Sp1-GC盒的结合究竟如何能影响转录。有时候需要几个转录因子才能起始