离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响_百度文库

1、离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响屠军波1, 杨壮群1, 姚天华2, 赵小鸽3(西安交通大学:1.口腔医学院口腔颌面整形外科;2. 口腔医学院中心实验室, 陕西西安710004;3. 医学院生物医学实验中心, 陕西西安710061摘要:目的观察神经生长因子(nerve growth factor , N GF 对离体培养条件下的人头皮毛囊生长的影响。方法在离体人头皮毛囊培养模型中, 加入100g L -1的N GF , 测量毛囊长度的变化以及24h DNA 合成率。结果目镜测微器观测100g L -1的N GF 与125mg L -1的米诺地尔一样能明显地促进游离的人头皮毛囊生长(P &l

2、t;0. 05 , 尤以前8d 较为明显; 3H 2TdR 掺入检测的DNA 合成率亦明显增高。结论100g L-1的N GF 对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用。关键词:毛囊; 体外培养; 神经生长因子中图分类号:R322.995文献标识码:A文章编号:167128259(2004 0220127203E ffects of nerve grow th factor on human hair follicles in vit roTu J unbo , Yang Zhuangqun , Yao Tianhua , Zhao Xiaoge (Department of Oral and Ma

3、xillary Surgery , Stomatological College ofXi an Jiaotong University , Xi an 710004, China ABSTRACT :Objective To observe t he eff ects of nerve growt h f act or (N GF on growt h of human hair f ollicles in vitro. Methods N GF was added t o t he model of human hair f ollicles in vitro. The lengt h a

4、nd t he DNA synt hesis rate of human hair f ollicles in vitro were measured. Re sults We f ound bot h 100g L -1N GF and 125mg L-1minoxidil significantly accelerated t he growt h of human hair f ollicles in vitro (P <0. 05 , esp ecially in t hep revious 8days. The rate of incorp oration of 3H 2Td

5、R was obviously higher t han t hat of t he cont rol.Conclusion N GF of 100g L-1significantly p romotes t he growt h of human hair f ollicles in vitro.KE Y WOR DS :hair f ollicle ; culture in vitro ; nerve growt h f act or (N GF 收稿日期:2003205230修回日期:2003209226基金项目:2002西安交通大学自然科学研究基金; 西安交通大学口腔医院青年科研基金(

6、YQ2001203作者简介:屠军波(19722 , 男(汉族 , 主治医师, 在读博士.含有色素毛发的生长需要上皮性成份、间质性成份和神经外胚层成份间精密的相互作用来完成。毛发与神经从起源到分布都提示二者之间有着千丝万缕的联系。研究发现毛囊中有神经营养因子及其受体的表达, 体内实验也发现神经介质对毛囊的生长有一定的影响, 特别是近年来基因剔除鼠和转基因鼠的研究进一步提示毛囊的生长存在神经调控机制。神经生长因子(nerve growth factor , N GF 是神经营养因子中有代表性的一种, 毛囊中也有其蛋白和受体的表达。我们构建了游离的人头皮毛囊器官培养模型, 观察了N GF 对毛囊生长

7、的影响。1材料与方法1. 1标本来源整形外科除皱头皮和神经外科切口周边头皮(年龄1845岁 。1. 2培养基与试剂配制的Williams E 无血清培养基(G iboco , 加入各成份的终浓度分别为:谷氨酰胺(Sigma 2mmol L-1,Hepes 2mmol L-1, 氢化可的松10g L -1, 转铁蛋白(Sigma 10mg L -1, 亚硒酸钠10g L -1, 牛胰岛素(Sigma 10mg L -1, 青霉素10×104U L-1, 链霉素100mg L-1。N GF 与米诺地尔购于Sigma 公司; 3H 2TdR 购于北京原子能研究所。1. 3离体人头皮毛囊培养

8、参照Philpott1方法,在超净工作台中, 将头皮于术后尽快取回, 清洗消毒后剪成约0. 5cm 宽的皮条, 浸入Willams E 培养基中待分离。用眼科剪刀将皮条从真皮和皮下组织交界处剪开, 以显微外科镊顺毛囊方向将毛囊与周围组织钝性分离, 轻轻夹住毛囊远端小心从皮下组织中倒拔毛囊。注意不要伤及毛乳头和真皮组织鞘, 并小心去净毛囊周围的脂肪组织。解剖显微镜下选取完整无损伤的生长期毛囊进行培养, 游离的毛囊小心移入24孔培养板中, 每孔1根毛囊, 加入0. 5mL Willams第25卷第2期2004年4月西安交通大学学报(医学版J our nal of Xi an J iaot ong

9、U niversity (Medical Sciences V ol. 25N o. 2Ap r. 2004E 无血清培养基,37,50mL L -1(5% CO 2恒温孵育箱中悬浮培养。24h 后选生长明显的毛囊(0. 1mm 加入N GF 或米诺地尔继续培养, 无需换液。1. 4实验分组我们共培养成功了约100根毛囊,随机取72根毛囊, 分成3组, 每组24根。第一组为空白对照组, 单纯毛囊培养组; 第二组为阳性对照组, 加入米诺地尔125mg L -1; 第三组为N GF 组, 加入的N GF 质量浓度是100g L -1。1. 5毛囊形态观察与长度测量每组随机18根毛囊, 每天在倒置显

10、微镜下连续观察毛乳头、真皮组织鞘、内皮根鞘、外皮根鞘及毛干的变化。每天目镜测微器测量毛囊长度。另外取部分正常培养的毛囊, 以冰冻包埋剂(OCT 包埋, -21下作10m 厚的冰冻切片,HE 染色。1. 63H 2TdR 掺入与测定每组6根毛囊, 加入3H 2TdR 使其终浓度为2mCi L-1, 继续培养24h 。取出毛囊,0. 01mol L -1PBS 冲洗3遍, 置于闪烁杯中, 加入20mL L -1(2% 乙酸200L ,70水浴至毛囊全部溶解, 加入二氧六环闪烁剂6mL , 液闪记数。测量3遍, 取平均值。1. 7统计学处理生长长度用单侧t 检验。2结果2. 1离体毛囊形态变化倒置显

11、微镜下观察毛干与内外根鞘都有明显的延长, 而结缔组织鞘则无明显变化(图1 。毛囊中毛干、内皮根鞘、外皮根鞘和结缔组织鞘各个层次清晰, 毛乳头呈锥形嵌入毛母质中。毛囊生长末期, 毛干与内皮根鞘之间的界限开始模糊不清。毛球与毛干上移, 毛球形态不规则, 毛根变成杵状(图2 。冰冻切片结果观察:冰冻切片HE 染色光镜下观察可见毛皮质、毛小皮、内皮根鞘、外皮根鞘及结缔组织鞘等结构。其中毛皮质呈灰紫色, 下部可见黑素颗粒; 内根鞘细胞胞浆呈深红色; 外根鞘细胞为多层, 呈蓝紫色; 结缔组织鞘和毛乳头呈淡红色。生长快的毛囊外根鞘柱状细胞层数较多, 胞核颜色较深, 毛乳头体积较大(图3 , 而生长慢的毛囊外

12、根鞘细胞为淡蓝色或淡红色, 与内根鞘及结缔组织鞘的颜色相近, 部分毛囊下段轻度弯曲(图4 。图1毛囊培养5d 时, 结缔组织鞘无延长, 毛干与内外根鞘等率延长Fig. 1The hair shaft and internal and external root sheath had e qual elongation when the hair follicles were cultured on day 5×40图2毛囊培养9d 时, 毛根变成杵状Fig. 2The hair root changed to pestl shape when the hair follicles w

13、ere cultured on day 9×40图3生长快的毛囊外根鞘柱状细胞胞核颜色较深, 毛乳头体积较大Fig. 3The columnar cell nucleus of external root sheath in hair follicles which grew quickly were deep staining , and the papilla of hair were comparatively big ×40图4生长慢的毛囊外根鞘细胞与内根鞘及结缔组织鞘的颜色相近, 部分毛囊下段轻度弯曲Fig. 4The staining of external r

14、oot sheath , internal root sheath and dermal root sheath were similar , and the inferior se gments of some hair follicle were lightly curvature ×402. 2离体毛囊生长长度如图5所示, 目镜测微器测量毛囊长度发现:100g L -1的N GF 与125mg L-1的米诺地尔一样对离体培养的人头皮毛囊的生长有明显的促进作用(P <0. 05 。2. 33H 2TdR 摄入率3H 2TdR 摄入量以毛囊c min -1(R 表示, 计算方

15、法为:R =(每杯实测c min-1值-本底c min -1值 /每杯毛囊数。如表1所示,N GF 组与米诺地尔组的3H 2TdR 摄821西安交通大学学报(医学版第25卷入量明显增加, 即24h 的DNA 合成率明显增高。 图5各组前8d 生长状况Fig. 5The growth status of every group during the first 8days表1各组24h 3H 2TdR 摄入量Table1The rates of incorporation of 3H 2TdR (c min -1Group BackgroundNegative1422. 6672034. 000

16、2509. 333R237. 11339. 00418. 223讨论在离体培养条件下, 我们通过目镜测微器测量毛囊长度发现100g L -1的N GF 与125mg L -1的米诺地尔一样对人头皮毛囊有促生长作用。3H 2TdR 摄入实验也说明N GF 与米诺地尔组的毛囊24h DNA 合成率明显增高。实验结果说明100g L -1的N GF 对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用。最初神经营养因子是作为神经发育调节剂被发现和鉴定的。现在人们已熟知神经营养因子有着更广泛的功能。根据同源性大小, 基因表达部位和蛋白作用的专一性以及信号传递机制的不同, 可将神经营养因子分为三个家族:神经生长因子家族、

17、睫状神经营养因子家族和胶质细胞源性神经营养因子家族。神经营养因子和它们的受体在多种细胞中都有表达, 包括角朊细胞。有研究表明N GF 刺激角朊细胞增殖并且是角朊细胞的存活因子, 可能是通过保持抗凋亡原癌基因产物Bcl 22的相对水平来实现的2。近年来, 许多研究已表明神经营养因子(主要是神经生长因子家族和胶质细胞源性神经营养因子家族 在毛囊的生长发育中起着关键性的作用。“一夜愁白头”与周围神经损伤患者相应区域的毛囊萎缩现象提示神经对毛囊的营养作用。动物实验切除脊髓后根或周围神经后毛发生长受阻, 也佐证了上述观点。小鼠的皮肤有3组水平走向的神经丛:表皮下神经丛、真皮下神经丛和皮下组织神经丛。其中

18、真皮下神经分出神经纤维围绕毛囊峡部形成毛囊峡部神经网3。这又从组织形态上证实神经与毛囊的生长有密切的关系。毛囊既分泌神经营养因子又是神经营养因子的靶器官。毛囊的神经营养因子既有来自雪旺细胞和神经旁分泌的, 也有来自毛囊本身自分泌的。在毛囊的形态发生中,N GF 、N T3、N T4和BDN F 都有表达。最近就有研究表明N GF mRNA 和它的翻译产物在生长期羊毛囊中有表达, 位于增生的毛球部及其上方的分化细胞4。同时, 神经营养因子的受体TrkA 、TrkB 、TrkC 和p75N GFR 在毛囊形态发生中也有表达。低亲和力受体p75N GFR , 可结合N T3、N T4、BDN F 和

19、N GF , 位于隆突部周围间质细胞和隆突部的下方。最近又发现p75N GFR 信号途径与退行期角朊细胞凋亡有关5,p75N GFR 剔除鼠的退行期也明显迟缓6。在研究中又发现, TrkA 在毛囊形态发生的各期表皮中都有表达, 而p75N GFR 则在7,8期毛囊中彻底消失7。因而可以推断,N GF 控制毛囊形态发生后期可能是通过TrkA 信号通路起作用的。基因研究表明毛囊形态发生中不仅表达N GF 和TrkA , 而且胚胎鼠过表达N GF 在转基因鼠皮肤中可轻度加速毛囊的形态发生。N GF 基因剔除鼠表现出延缓毛发生长;N GF 缺乏鼠毛囊生长受限, 毛发周期缩短且毛囊过早进入退行期。而转基

20、因成鼠过表达N GF (在启动子14作用下 则表现出加速退行期8。在有毛皮片器官培养中,N GF 可显著增加处在8期的毛囊比例。鼠皮片器官培养时N GF 刺激休止期毛囊的角质形成细胞增殖, 而对处于增殖期高峰(生长早期 的毛囊角质形成细胞却表现抑制作用9。这种相反的作用或许与细胞周期或细胞分化有关。临床现象和实验研究表明神经对毛囊的作用机制可能有两种:一是通过调控毛囊周围的血管分布对毛囊营养进行调控; 另一种就是皮肤神经通过分泌一些因子作用于毛囊, 从而调控毛囊的增殖、分化和凋亡8。我们的实验结果说明100g L -1的N GF 对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用。在去除体液、神经等其他影响因

21、素的条件下, 证明N GF 对离体的人头皮毛囊的促生长作用是直接的。一方面可能是通过本身的受体通路直接刺激毛母质细胞和外皮根鞘细胞增殖实现的, 另一方面可能是促进毛乳头细胞分泌一些促上皮形态发生物质和生长因子, 从而间接调节毛囊生长。具体的机制有待于进一步研究。(下转第141页增生, 基底膜增厚, 管腔狭窄甚至闭塞, 神经的缺血缺氧已经达到了相当高的程度; 此时, 业已下降的NO 对血管功能的微弱调节不足以对神经血供造成显著的影响, 因而对神经功能损害的加重不起主要作用。血管因素的其他方面及代谢因素8可能在DPN 的发展中占主导地位。有实验表明, NO 供体或合成原料L 2arg 的补充, 可

22、使神经内血流灌注有显著性恢复。自由基清除剂也可通过减少自由基对NO 灭活改善神经内血流及神经传导速度。多项实验研究的结果证实, 内皮源性NO 的减少对神经内血流供应有显著影响, 说明NO 在糖尿病神经病变发生的血管机制中占重要地位。神经血液供应的减少导致神经缺氧, 进而引起神经营养受损、再生障碍。本研究通过检测22DM 患者血清NO 水平, 对NO 与22DM 及DPN 的关系进行了初步探讨, 发现22DM 患者血清NO 水平的变化是一个随病程变化的过程。代谢紊乱的早期, 血清NO 显著升高; 随着病程的延长, 血清NO 逐渐下降; 至疾病中晚期, 血清NO 较正常人群显著降低; 这种变化可能

23、涉及到糖尿病血管病变的发生; 22DM 患者DPN 的发生与血清NO 水平密切相关;DPN 的发展与血清NO 无明显关系。而DM 发生时NO 减少引起DPN 发生的具体机制尚待进一步研究。参考文献:1Wascher TC , Graier W F , Ba hador B. Ti me course of endot helialdysf unction in diabetes mellitus J . Circulation ,1994, 90(2 :1109-1110.2Tolins TP. Abnor mal renal he mod yna mic resp onse t o redu

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