Intermedin在两肾一夹高血压大鼠中的表达(一)

1、Intermedin在两肾一夹高血压大鼠中的表达(一)    作者：梁颖， 薛立华， 黎济荣， 闫琳， 芦宁清， 贾月霞【关键词】 Intermedin;两肾一夹;肾性高血压;免疫组化高血压是心血管系统的常见多发病，可引起心、脑、肾等靶器官的损害，对患者的危害极大。中叶素(intermedin,IMD)是Roh等人在2004年1用系统进化分析法以降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related pep-tide，CGRP)超家族成员特异的一二级结构检索基因库得到的该家族的一个新成员。初步的功能研究显示，在心血管系统IMD具有CGRP超家族

2、成员如肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)相似甚至更强的舒张血管、降低血压等生物学效应。本研究建立2K1C高血压大鼠模型，旨在观察IMD在肾脏和腹主动脉中的表达及其意义。1 材料和方法1.1 主要试剂及仪器 BP-6动物无创血压测量系统和BL-420F+生物机能实验系统均由成都泰盟科技有限公司提供，OLYMPUS显微镜、IPP6.0(Media cybermetics inc)、兔抗IMD单抗由美国PhoenixPharmaceuticalINC提供，二抗(PV-9001)即用型试剂盒、DAB试剂盒和PBS缓冲剂均购于北京中杉金桥生物技术公司。1.2 动物模型的建立和分组 雄性

3、SD大鼠(购自宁夏医科大学实验动物中心)，体重170180 g，在清洁级动物房喂养，饲以普通饲料(由本校实验动物中心提供)，自由饮水，适应性饲养3d后进行实验。按傅继华22K1C高血压模型复制的方法，制作2K1C模型，20只雄性SD大鼠随机均分为正常组、模型组，术前禁食过夜，自由饮水，用1%戊巴比妥钠(35 mg·kg-1)麻醉，上腹部正中切口，沿腹白线逐层分离，暴露肾脏及肾动静脉，玻璃分针分离动静脉，用直径为0.2mm的银夹钳夹左肾动脉，使其部分狭窄制作2K1C高血压模型。正常组除不放置银夹外，其余手术操作同上，术后正常进食与喂水。术后3d给予青霉素50000U腹腔注射预防感染。1

4、.3 血流动力学的测量和标本的留取 正常饲养4周后，麻醉，称重，左颈总动脉插管连接BL-420E+生理记录仪记录mCAP(颈动脉平均压)、LVEDP(左心室舒张末期压)及LV±dp/dtmax，并计算RK/LK、LVM/BW(左心重与体重比)，然后从插管处放血处死动物，摘取肾脏和腹主动脉。取肾脏组织最大切面和腹主动脉横切面用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片。1.4 免疫组织化学方法检测IMD在肾脏和腹主动脉组织中蛋白的表达 肾脏和腹主动脉组织切片脱蜡入水，蒸馏水洗5 min，PBS洗5 min×2次，滴加1滴3%H2O2溶液，室温放置15 min，PBS洗5 min&#

5、215;3次，滴加10%正常山羊血清封闭20min，室温20 min，甩净不洗，滴加兔抗IMD单抗 (1500工作浓度)，4孵育过夜，室温复温30min，PBS洗3 min×3次，滴加扩增剂室温放置20min，PBS洗3 min×3次，滴加二抗室温静置30 min，PBS洗3 min×3次，DAB染色35 min，显微镜下观察染色程度，蒸馏水终止反应，苏木素复染30s，1%盐酸酒精分化，自来水返蓝，常规脱水透明，中性树胶封片，镜检。结果判定：用低倍和高倍镜观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，胞浆染成棕黄色，染色明显高于背景。应用IPP6.0(Media cy

6、bermetics inc)对表达结果进行半定量分析(以累积光密度进行比较)。1.5 统计学方法 结果以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 鼠尾动脉压 各组术前收缩压(SBP)无明显差异，模型组术后1周尾动脉压开始升高，4周显著增高，与正常组相比差异有统计学意义(P0.01)，提示2K1C模型成功 (见表1) 。表1 大鼠鼠尾动脉压、mCAP、LVEDP、LV±dp/dtmax、LVM/BW以及RK/LK的比较(±s，n=10)2.2 血流动力学的测量以及LVM/BW和RK/LK的比值 结果显示模

7、型组大鼠mCAP、LVEDP、LVM/BW以及RK/LK分别比正常组升高48.23%(P0.01)、340%(P0.01)、36.77% (P0.05)、26.35% (P0.01)，而LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax模型组大鼠比正常组降低了51.26%和24.65%(P0.01)，见表1。3 讨论高血压是一种以体循环动脉压升高为主要特点的临床综合征，可导致靶器官如心脏、肾脏、脑和血管的损害，并伴有全身代谢性改变3。体内也存在着多个血压调节系统，确保机体血压水平适应复杂多变的体内外环境，肾素-血管紧张素系统(RAS)就是其中之一4。本实验采用经典的肾素依赖性高血压动物模型，即两肾

8、一夹肾性高血压大鼠模型。由于一侧肾动脉的机械性狭窄，导致肾脏灌流不足，激活体内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统，导致血管收缩功能障碍、血压升高、血流动力学异常、血管壁应切力增加等病理状态。一些新的内分泌生物活性肽，特别是心血管活性肽正在不断被发现，在血压调节中的作用是近年来研究“热点”。其中降钙素基因相关肽作为体内最强的内源性舒血管和抗血管平滑肌细胞增殖物质，通过直接舒张阻力血管、改善血流、舒张肾动脉、增加肾小球滤过率、促进钠盐排泄、对抗血管平滑肌细胞增殖、促进内皮生长和修复而与高血压有较密切关系，在体内含量减少是血压升高原因之一，而反馈性分泌增加又是机体对抗高血压方式之一。实验证明Ang5和U

9、 II 6在高血压时血浆浓度升高具有收缩血管、升高循环血压的作用，而Apelin7和ADM8在高血压时血浆浓度升高有扩张血管、降低循环血压的作用。杨靖辉等9在大鼠离体灌流的血管环上观察到IMD具有内皮依赖的舒血管效应。Roh 等1 给自发性高血压大鼠(Spontane-ous hypertensive rat, SRH) 持续、大剂量静脉注入IMD，可降低平均动脉压并具有扩张血管和改善心肌肥厚的作用。但是IMD是否有降低2K1C肾性高血压大鼠平均动脉压并具有扩张血管作用至今还未见报道。本研究结果表明，模型组大鼠mCAP、LVEDP、LVM/BW、LK/RK均显著高于正常组，说明两肾一夹动物模型

10、复制成功。应用免疫组织化学方法检测大鼠肾脏和腹主动脉中IMD的表达，发现模型组大鼠明显高于正常组大鼠。表明肾性高血压大鼠血管和肾脏对IMD的反应性升高，文献报道IMD与CGRP和 ADM有类似的生物学效应12，并由此推测肾性高血压大鼠IMD增加可能对于降低血压具有代偿意义。腹主动脉及肾小球IMD蛋白上调可能参与了肾性高血压的发病过程。IMD的上调可能是血管及肾脏一种适应性保护反应，提示内源性IMD可能参与肾性高血压发生的内源性防御机制。【参考文献】1 Roh J,Chang CL,Bhalla A,et al. Intermedin is a calcitonin/calcitonin gen

11、e-related peptide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying protein receptor complexes J.J Biol Chem,2004, 279(8):7264-7274.2 傅继华，陈宇飞，张琪，等.肾性高血压大鼠实验模型制作改进J.中国药科大学学报，1995,26(6):383-384.3 王吉耀.内科学M.北京：人民卫生出版社，2001:229.4 徐俊斌，陈宝田.丹蔑降压冲剂对二肾一夹型高血压大鼠血压的影

12、响及其机理研究J.中国中西医结合杂志，2003,6(23):26-28.5 刘军翔，宋冬林，张方宁,等.复合离子盐对两肾一夹高血压大鼠心肌肥厚的影响J.天津医药，2008,36(12):958-960.6 Song W, AshtonN, Balment RJ. Aradioimmunoassayto detect urotensinin the plasma of rat models of hypertensionJ.J Physiol,2002, 544(2): 107.7 Lee DK, Cheng R, Nguyen T,et al. Characterization ofapelin, the ligand for the APJ receptorJ. J Neurochem,2000,74(1): 34.8 Yanagawa B, Kataoka M, Ohnishi S,et al. Infusion ofad