银杏叶制剂对蛛网膜下腔出血早期大鼠脑缺血的影响

1、银杏叶制剂对蛛网膜下腔出血早期大鼠脑缺血的影响关键词：蛛网膜下腔出血；脑缺血；内皮缩血管肽类；大鼠中国病理生理杂志000320摘 要 目的：探讨银杏叶制剂(GBE)对蛛网膜下腔出血(SAH)早期缺血性脑损伤的防治作用。方法：对假手术组(SO组)、SAH组和SAH+GBE组大鼠检测24h内局部脑血流量(rCBF)、脑组织内皮素-1(ET-1)含量和Ca含量改变，并对海马CA1区组织作光镜检查。结果：SAH组于术后rCBF迅速而持续降低，脑组织ET-1含量和Ca含量在诱导SAH 1 h后均显著高于SO组，3 d后海马CA1区神经元明显受损。 SAH+GBE组的上述改变均较轻。结论：GBE可减轻SA

2、H后缺血性脑损伤。中分类号 R 743.35 文献标识码 A文章编号 1000-4718(2000)03-0266-03Effect of Ginkgo biloba extract on cerebral ischemia during early stage of subarachnoid hemorrhage in ratsSUN Bao-liang, XIA Zuo-li,YANG Ming-feng(Institute of Microcirculation, Affiliated Hospital, Taishan Medical College, Taian 271000, Ch

3、ina)GE Bao-lin(Department of Pathophysiology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021,China)Abstract AIM: To investigate the effect of Ginkgo biloba extrac (GBE) on cerebral ischemia during early stage of subarachnoid hemorrhage (SAH). METHODS: Noncraniotomy models of SAH in Wistar rat

4、s were used and animals were divided into sham-operated group, SAH group and SAH+GBE group. Dynamic change of regional cerebral blood flow (rCBF) was detected. Brain endothelin-1(ET-1) and calcium contents were also determined at different time point during 24 hours after the operation. Pathological

5、 change of neurons of hippocampus CA1 region was observed. RESULTS: In SAH group, rCBF decreased immediately and persistently after induction of SAH. Values of brain ET-1 content and calcium content at 1 hour, 6 hours and 24 hours were significantly higher than those in sham-operated group. Neurons

6、of hippocampus CA1 region were damaged severely 3 days after onset of SAH. Above abnormal changes in SAH+GBE group were much slighter than those in SAH group. CONCLUSION: GBE may relieve cerebral ischemic damage after SAH.MeSH Subarachnoid hemorrhage; Cerebral ischemia; Endothelins; Rats蛛网膜下腔出血(suba

7、rachnoid hemorrhage,SAH)后，可通过不同的机制造成脑缺血性损伤，由此使患者具有较高的病死率和神经功能伤残率1。银杏叶制剂(Ginkgo biloba extract,GBE)具有多种药理活性，并已在大脑功能不全、间歇性跛行及某些脑和血管性疾病中显示出突出疗效2。本研究用大鼠SAH模型，观察GBE对SAH后缺血性脑组织的保护作用。材 料 和 方 法一、动物与分组体重300350g的Wistar大鼠，雌雄兼用，随机分为假手术(sham-operated,SO)组8只、SAH组和SAH+GBE组各32只。后组GBE(徐州邳州制药厂，质控指标为含银杏总黄酮甙27.5%,批号950

8、322)于术前30 min按15 mg/kg腹腔注射给药,每隔6 h以同样的剂量追加1次。每组各用8只动态检测局部脑血流量(regional cerebral blood flow, rCBF)，并对其中各5只于3 d后作海马CA1区组织光镜检查；每组各取部分动物(SO组8只，SAH组和SAH+GBE组各24只)检测不同时间脑组织内皮素-1(endothelin-1, ET-1)和Ca含量。二、动物模型复制参照Bederson等1的非开颅性方法，自大鼠右侧颈内动脉导入经10 mol/L硝酸处理过的日本产碧水3号渔线(直径0.285 mm)至颈内动脉颅内段,刺破脑底动脉环的右前部造成SAH。三、

9、rCBF检测在动物前囟后及中线左侧各3 mm处钻一直径23 mm小孔，在立体定向仪控制下，将激光多普勒血流计(LDF-pf2型，瑞典Perimed公司)探头垂直置于硬脑膜测量rCBF。四、脑海马区组织ET-1含量测定将大鼠分别在不同时间断头处死，迅速分离海马组织，加1 mol/L醋酸(w/v=10%)，在水浴中煮沸10 min后匀浆。ET-1含量的测定采用放免法，试剂盒购于解放军总医院东亚免疫技术研究所。五、脑海马区组织Ca含量测定将分离的海马组织烘干称重后用混合酸(硝酸高氯酸=31)充分低温湿法消化，用去离子水定容。利用火焰吸收法，在M3100型原子吸收分光光度计(美国PE公司)上测定Ca含

10、量，波长为422.7 nm。六、脑海马组织形态学检查3 d后将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后开胸，自左心室穿刺入主动脉，用血管钳夹闭降主动脉，剪开右心耳。以120 cm H2O压力，先用生理盐水100 mL灌流，再用4%多聚甲醛溶液100 mL灌注固定脑组织。将大脑放入4%多聚甲醛溶液中继续固定24 h。在视交叉后1 mm处行冠状切开，常规切片，HE染色，对海马CA1区行光镜观察，计数其正常的神经元数量，并按下式计算神经元密度：神经元密度(神经元数/mm)=CA1区正常神经元数CA1区总长度(mm)七、统计方法实验数据用s表示，采用配对或组间t检验判断均数差异的显著性。结 果一、SAH模型的验证SO组

11、大鼠颅脑解剖无异常发现。在所有SAH模型动物的蛛网膜下腔，均发现有大量的血液或血凝块，呈弥漫性分布。均未发现脑实质的手术损伤。二、rCBF变化结果见表1。SO组动物在实验过程中rCBF保持相对恒定。SAH组在产生SAH后rCBF立即降低，1 h下降至最低值，在24 h内持续在低水平状态。SAH+GBE组在 SAH后rCBF下降的速度较慢，降低的程度明显小于SAH组。表1 各组大鼠rCBF变化Tab 1 Alteration of rCBF during the experiment in each group(s,n=8,LDF unit) GroupPreoperationPostopera

12、tion00.51624(h)SO809.557.6775.169.1797.841.2839.378.2785.037.7807.254.3SAH821.487.3580.079.2*443.640.2*360.643.3*430.257.2*399.665.4*SAH+GBE818.162.6737.363.7*643.755.0*563.142.0*612.373.4*714.053.3*P0.01, vs preoperation or SO; P0.01,vs SAH三、脑海马区组织 ET-1含量和Ca含量改变结果见表2。在术后124 h，SAH组脑海马区组织ET-1含量明显高于SO

13、组。SAH+GBE组在SAH后6 h、24 h脑海马区组织ET-1含量均较 SAH组明显为低。SAH组在诱导SAH后1 h、6 h、24 h脑海马区组织Ca含量较SO组为高，以24 h最为明显。SAH+GBE组上述各时间的脑海马区组织Ca含量均显著低于SAH组。表2 各组大鼠脑海马区组织ET-1含量和Ca含量变化Tab 2 Alteration of hippocampus ET-1 content andCa content in each group(s,n=8) GroupET-1(pg/mg)Ca(mol/g dry brain)SO7.123.0211.381.79SAH1 h po

14、stoperation10.933.91*14.952.32*6 h postoperation17.615.19*19.992.69*24 h postoperation18.375.00*24.542.13*SAH+GBE1 h postoperation9.323.4813.031.736 h postoperation11.633.05*16.571.84*24 h postoperation12.124.17*18.411.43*P0.05,*P0.01, vs SO;P0.05,P0.01,vs SAH四、海马CA1区组织形态学变化在手术后3 d，SO组海马皮质CA1区形态正常，锥

15、体细胞着色均匀，核略呈椭圆形，辐射层纤维较长而呈垂直排列。SAH组海马 CA1区锥体细胞数目明显减少，且多深染变暗或固缩。而SAH+GBE组海马CA1区锥体细胞则得以较好保存。SO组、SAH组、SAH+GBE组海马CA1区神经元密度分别为(213.7426.32)个/mm,(96.3035.78)个/mm和(178.8341.60)个/mm;SAH组明显低于SO组(P0.01)，而SAH+GBE组又显著高于SAH组(P0.01)。讨 论本实验观察到，大鼠SAH后rCBF迅速而持续降低，在所观察的24 h内无明显恢复，提示有脑缺血发生。SAH后rCBF减低的原因可能包括脑部主要血管的痉挛、脑灌注

16、压降低以及脑微循环功能状态异常1,3。实验还表明，SAH后脑组织ET-1含量和Ca含量明显增多，海马CA1区锥体细胞明显受损。SAH时对脑血管的牵张与刺激、脑灌注压下降、红细胞释放的氧合血红蛋白等物质，以及继发性缺血缺氧刺激，可使血管内皮细胞、某些神经元或胶质细胞ET-1 mRNA表达而产生过多的ET-1。ET-1的增加可造成脑部大血管和微血管痉挛而导致脑缺血；同时还可能通过促进谷氨酸等兴奋性氨基酸释放，以及激活磷脂酶C和间接开放电压依赖性Ca2+通道，使神经细胞内Ca2+超载，而加重脑组织缺血性损伤4。GBE主要含有黄酮类和萜内酯类等化学成分。前者包括30多种化合物，后者主要由银杏内酯A、B

17、、C、M、J和白果内酯组成。本实验表明，GBE可阻止SAH后rCBF下降、脑组织ET-1和Ca含量的增加，并能显著减轻海马CA1区锥体细胞损伤。既往的研究证实2,GBE可扩张外周血管、冠状血管和脑血管。GBE中的黄酮类化合物具有抗炎及抗自由基作用5，因此可以减轻SAH时上述因素对血管内皮细胞的损伤，减少ET-1的病理性释放。而银杏内酯(尤其是银杏内酯B)是特异的血小板激活因子(platelet activating factor, PAF)拮抗剂2，因此可防止SAH时PAF诱导的血小板、白细胞聚集粘附对血管内皮细胞的损伤6，从而改善血管内皮细胞功能，减少内皮源性ET-1的过度释放。银杏内酯亦可

18、能阻断PAF诱导血小板释放的5-羟色胺、三磷酸尿苷等的血管收缩作用6。GBE中的黄酮类和萜内酯类物质均可清除超氧阴离子等自由基5，从而使一氧化氮半衰期延长，进一步抑制ET-1的合成和释放。随着脑缺血刺激的缓解，神经元和胶质细胞等生成的ET-1亦逐渐回降。ET-1水平的回降可使脑部血管的痉挛得以缓解，改善脑血供；同时减轻了ET-1的神经毒作用。已知自由基和PAF均参与了脑缺血损害过程。因此，具有抗自由基效应和PAF拮抗剂特性的GBE亦可能提高脑部神经元对缺血缺氧的耐受性68。但其具体机制尚待进一步探讨。参 考 文 献1 Bederson JB, Germano M,Guarino L. Cort

19、ical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in rats J. Stroke, 1995,26:10861091.2 Kleijinen J,Kinpchild P. Ginkgo biloba J. Lancet, 1992,340:11361139.3 Todo H,Ohta S,Wang JZ,et al. Impairment in biochemical level of arterial dilative capabi

20、lity of a cyclic neucleotides-dependent pathway by induced vasospasm in the canine basilar artery J. J Cereb Blood Flow Metab，1998,18:808817.4 Zuccaerllo M, Romano A, Passalacqua M, et al. Decreased endothelium-dependent relaxation in subarachnoid hemorrhage-induced vasospasm: Role of ET-1 J. Am J Physiol， 1995,269: H1009H1015.5 Shen JG, Zhou DY. Efficiency of ginkgo biloba extract (Egb761) in antioxidant protection against myocardial ischemi