微生物产生的抗菌肽

1、微生物产生的抗菌肽研究状况闵建，李理(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)摘要：抗菌多肽是微生物、植物、动物中由基因编码，核糖体合成的具有抗菌活性的多肽、蛋白质、不同蛋白的复合物或者蛋白与糖、脂的复合物。动物和植物产生的抗菌多肽的研究比较成熟，大多都已经知道其抗菌机理，而微生物研究较多的抗菌多肽是放线菌产生的抗菌多肽，对于细菌、酵母、霉菌和藻类的研究较少，本文综述主要综述了国内外细菌、真菌、霉菌和藻类产抗菌多肽以及它们的抗菌机理。关键字：抗菌多肽，细菌，抗菌机理 Current Research on Antibacterial Polypeptides Produced by

2、 MicroorganismMin jian Li Li (College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: Antibacterial polypeptides are complexes conjugated with carbohydrate or lipids. These complexes are encoded by Gene and synthesized by Ribosome. Antibact

3、erial polypeptides isolated from animals and plants were well-known and the principles were studied. However, less antibacterial polypeptides were isolated from microorganism such as bacterium, yeast, mould and algae. The antibacterial polypeptides isolated from microorganism and the principles were

4、 reviewed in this paper.Keywords: antibacterial polypeptide, bacterial, principle 前言抗菌多肽是生物产生的一类抵御原微生物的防御反应的多肽，它的分子量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广等特定，有可能成为一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药，甚至可以通过基因工程的方法将抗菌肽基因导入到植物、动物和微生物内，用于大批量生产或进行动植物的抗病育种。抗菌多肽研究的兴起是在20世纪80年代，1980年Boman等从美国天蚕蛹中分离得到的天蚕素是第一个被发现的抗菌肽，后来很多从昆虫、动物、植物等生物

5、中不断的分离得到各种不同的抗菌多肽，其抗菌机理也不断被研究发现。微生物产生的抗菌多肽近年来也在不断的深入，本文综述了除放线菌以外的细菌、酵母、霉菌、藻类产抗菌多肽，介绍了这些抗菌多肽的特性及其抗菌机理。1 细菌产生的抗菌肽1.1 杆菌肽(bacitracin)杆菌肽是由地衣芽孢杆菌(Bacillus lichnifarimis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的一种短肽类的新型广谱抗菌素，它能够有效控G+和G-细菌，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）、艰难梭菌(Clostridium difficile)和一些古细菌(

6、Archaebacteria)、甲烷杆菌(Methanobacterium)、盐球菌(Halococcus) 1-2。杆菌肽极易溶于水、甲醇、二甲基亚砜，易溶于乙醇，微溶于丙酮、苯、醚类，不溶于氯仿,它有许多异构体，分别为杆菌肽A、A1、B、C、D、E、F1、F2、F3和G，这些异构体的结构示意图如图1，杆菌肽A的结构是由12个氨基酸组成含有噻唑环的多肽复合体3。它在酸性到中性的溶液中很稳定，然而在PH>9的溶液中时室温下就会很快降解2。图1 杆菌肽的结构示意图Fig.1 Schematic structure of bacitracin congeners杆菌肽必需与二价金属离子以1:

7、1的比例结合形成络合物才有生物活性，与金属离子的亲和力顺序为Cu2+>Ni2+>Co2+Zn2+>Mn2+4。杆菌肽的抗菌作用与它抑制细胞壁的合成有关，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，而抗菌肽却正好阻止了肽聚糖的合成，也有研究表明抗菌肽影响了细胞壁中氨基酸合成蛋白质再进一步形成细胞壁5-6。由于杆菌肽易吸潮，所以在生产发酵达到杆菌肽效价最高时，直接在培养液中加锌盐，生成较稳定的杆菌肽锌络合物。这种络合物在饲养业中应用很广，常用于抗生素饲料添加剂。这种抗生素饲料添加剂有许多优点7：理化性质较稳定，易保存；毒副作用小；适量添加无残留；无配伍禁忌，不产生抗药性，可长期使用。1

8、.2 短杆菌肽S(Gramicidin S, GS)GS是Bacillus brevis分泌的由10个氨基酸组成的环状肽类抗生素，它是1944年从前苏联的一个农场的土壤中分离发现的，其结构表示为Cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Phe-L-Pro)28-9。GS有很高的生物活性，对G+和一些病原菌都有显著的杀伤作用，但是它作用的专一性小，具有溶血细胞毒性和肝、肾的细胞毒性，所以限制了其应用范围10。CS的三维结构模型如图2，D-Phe-Pro构成了其两侧的-转角，两个三肽序列-Val-Orn-Leu-形成牢固的方式平行的-片层结构，Leu和Val的氨基质子和羧基之间氢键的形

9、成稳定了其分子的构象11。GS是同时具有极性和非极性表面的双亲结构:两个极性的、带正电荷的Orin的-(CH2)2-NH3+侧链和两个D-Phe的苯环突出在分子的一个面；4个Leu和Val的疏水侧链(-CH2-CH-(CH3)2和-CH-(CH3)2)伸出于分子的另一面，这种双亲结构对它的生物活性是非常必要的12。许多研究还显示，在各种极性的有机溶剂、洗涤剂胶团和磷脂双层的环境中，甚至在一些能使蛋白质发生变性的高温条件下，GS的构象都能够保持稳定，这同时说明它的这种双亲结构是非常稳定的。图2 GS分子结构及三维空间构象模型Fig.2 the molecular structure and th

10、e three dimensional model of GS在用较低浓度的GS处理敏感菌株后，发现氮和磷等细胞内含物首先从细胞中释放出来，其释放的量与药物的浓度呈正相关，从而推断GS可能与苯酚和一些表面活性剂具有相同的作用机理，即是通过与磷脂双层形成聚合物而破坏膜的结构，导致细胞内含物的释放而最终引起细胞的死亡12-13。一些关于GS与人工脂质体、生物膜作用的生物物理学研究表明，GS能强烈地分配进入到液晶态脂双层膜中，其精细的作用位点位于脂质双层磷脂分子的极性基头的表面区域，并与之发生静电相互作用，可以认为，疏水和静电相互作用对此抗生素的活性有重要意义14。对于不同的磷脂膜可能有不同的作用机

11、理，同时对于某一种特定的磷脂双层，肽的浓度或者膜的状态都会对其相互作用产生影响，所以很难构建出一个详细的关于GS与膜作用的模型15。1.3 多粘菌素E(polymyxin E)多粘菌E是由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的一种碱性多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用16。它可以治疗由志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单脆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌属(Salmonlla)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)引起的感染，并对霍

12、乱弧菌、鼠疫杆菌等也有良好的作用17。由于多粘菌素E具有良好的抗菌活力和高效、低毒、残留少的特性，所以可以用于饲料添加剂，促进禽畜生长和提高饲料的利用率，并且可以防止饲料大规模生产中产出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病18。多粘菌素E能吸附在细胞的细胞壁上，与脂蛋白游离磷酸基结合，破坏膜的通透性，使细胞内主要成分特别是嘌呤、嘧啶等从细胞浆中流出，细菌生长发生抑制或引起细胞死亡19。用多粘菌素抑制禽分支杆菌导出Mg2+外流实验更加证明了其独特的作用机制，与其它抗生素或抗药不会产生交叉耐药性，本类药间会产生交叉耐药性，但其耐药性不会通过R因子传播，因此扩散蔓延速度较慢。由于G-菌胞壁中含

13、有较多量的磷脂，而G+菌中的磷脂含量较低，因此对G-菌的效果比G+菌强10103倍20。其抗菌谱也仅限于G-菌，对G+菌不敏感。多粘菌素与TMP、庆大、红霉素、杆菌肽锌等合用，有协同及增效作用，弥补其抗菌谱的不足，降低多粘菌素的用量及毒性。与(E)-2-hexenal及吲哚合用，具有增效作用。与二价阴离子、季胺盐化合物、不饱和脂肪酸、碱性药物、肌肉神经阻断药物等合用，会降低疗效或增大副作用。1.4乳链菌肽(Nisin)Nisin是1个有34个氨基酸组成的五环多肽，其修饰氨基酸包括羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)、-甲基羊毛硫氨酸(Ala-S-Abu)、硫氢丙氨酸(Dha)和-甲基脱氢丙氨酸(D

14、hb)，如图3。其分子由两个结构域组成：N-端结构域(119位残基)，含有A、B、C 3 个硫醚环；C-端结构域(2334位残基)，含有D和E两个相互缠绕的环及靠近C-端的6个氨基酸残基。这两个结构域通过1个柔性铰链区(2022位残基)连接并且都具有疏水面和亲水面的双亲结构。Nisin的C-端结构域带有大量的正电荷，含有更多的亲水性氨基酸表现出亲水性，而其N-端结构域大部分是疏水基因，表现疏水性，可以与靶细胞的磷脂头端相互作用21。图3 乳链菌肽Z的分子结构Fig.3 Molecular Structure of Nisin Z乳链菌肽可以广泛抑制多种革兰氏阳性菌，其作用的起始靶位点在敏感菌的

15、细胞膜上，通过分散质子动力形成不连续的孔道，从而去除细胞膜的基本能量来源。孔道形成使维持生命必须的离子梯度、质子动力耗散。质子动力的耗散会终止一系列能量依赖反应，从而导致细胞死亡。Nisin可通过两种方式形成孔道，一种是Nisin在微摩尔级浓度下形成无靶目标介导孔道；另一种是Nisin在纳摩尔浓度下通过细菌细胞膜上的lipid的介导形成孔道，同时Nisin与lipid的结合抑制肽聚糖的生物合成22。1.5 枯草杆菌素(Subtilin)枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素有表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和Fengycin A、B三大类，结构为-氨基或羟基脂肪酸(10多个

16、碳)与7个或10个氨基酸以酰胺键连接的两部分，分子量从900到1500不等，脂肪烃及氨基酸种类、顺序随菌株、培养条件等改变而变化，从而引起活性特别是抗真菌活性的改变。它表现的抗真菌和一定程度的抗细菌活性，以及抗病毒、抗肿瘤、抗支原体活性23。枯草芽孢杆菌素对人体肠道中的产毒性大肠埃希菌、侵袭性大肠埃希菌、致病性大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌和福氏志贺菌、宋内志贺菌有较强的抑制作用24。Surfaction表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性，作用机理是破坏病毒的脂膜。Iturin和Fengycin具有强抗真菌活性，机理是影响真菌细胞膜的表明张力，导致微孔的形成、K+及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死

17、亡。脂肽类化合物可用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害以及蚜虫等虫害25。2 酵母菌产生的抗菌多肽酵母菌作为食品微生物用于发酵食品、饮料、肉的保藏，其机理是利用酵母菌的代谢物具有抑菌活性的特性，一般认为酵母菌的抑菌活性是通过代谢物乙醇、亚硫酸盐、乳酸等具有杀菌作用的小分子物质，肽类、吡嗪衍生物类及未知组成成分的抗菌素，杀菌素糖蛋白而产生的。有关酵母产抗菌素的报道很少，但是仍然有人尝试从酵母中提取抗菌素，内蒙古农业大学的李丽杰26就尝试了在酸马牛奶酵母属中寻找到了5株有抑菌活性并分析了抑菌物质，证

18、明这种抑菌物质不属于标准六大类抗生素，是中性物质，并且是一种混合物，含有四种成分，推测其中三种是蛋白质，分子量分别在16300、22100和25900左右，但是就其杀菌机理还不清楚。也有报道27自然界中存在这嗜杀酵母，在其生长繁殖过程中能向菌体上分泌一种毒蛋白，这种毒蛋白能杀死同族或亲缘酵母，但自身具有免疫力。这种嗜杀酵母产生的毒素蛋白对敏感菌株致死作用的机理是它能在敏感酵母细胞的细胞膜中形成离子通道，使K+、ATP等物质外泄，促使蛋白质、核酸等大分子物质在细胞内的合成停止，导致细胞死亡28。3 霉菌产生的抗菌多肽1991年，Sin-ya Kobaysi等29从少孢根霉(Rhizopus ol

19、igosporus IFO8631)的培养液中提取到一种相对分子量约5500的肽类抗生素物质，它对枯草芽孢杆菌和革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较强的抑制作用。1992年，王昌禄等30从中国小甜酒药中分离出一株根霉(Rhizopus chinesis NO12),该菌可产生具有抑制枯草芽孢杆菌的抗生物质，对其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌(S ta.aureus)、乳脂链球菌(S tr.crem oris)等也有抑制作用，并且初步推断其为多肽物质。有关霉菌产抗菌多肽的报道很少，从现在所有的文献来看就只查到这两株根霉具有产抗菌多肽的能力，而且这两株根

20、霉都是从能食用的发酵物中分离得到的，所以对人体无毒害的作用，开发出这种抗菌多肽很有前景。4 藻类产抗菌多肽 海洋资源是待开发的一个潜在的资源地，在广阔的海洋中，分布着3万余种含有丰富生理活性物质的海藻，海藻生物活性物质已成为海洋科学研究的热点之一，由于海洋的特殊性，使海洋中存在这陆生植物所没有的特殊成分及药理成分。研究海藻抗菌活性化合物主要是脂类、脂肪酸、多糖及萜类等，而对于海藻多肽海藻蛋白提取物抗菌的研究很少。福建农林大学的刘振宇等人31报道测定8中海藻的硫酸铵分级盐析蛋白对其菌丝生长和分生孢子萌发的作用效果，发现8种海藻的不同蛋白组分对香蕉炭疽杆菌菌丝生长和分生孢子萌发的作用效果不同，其中

21、蛋白质组分能抑制菌丝生长，有些能抑制其分生孢子的萌发，使其萌发率降低，并对孢子萌发的芽管长度、着生位置、芽管数产生影响，所以海藻中的一些蛋白对香蕉炭疽杆菌具有抑制作用。陈国强等人32也报道检测了三种海藻粗蛋白对6种植物病原真菌菌丝生长及孢子萌发的抑制效果，结果表明3种海藻的粗蛋白对6种真菌的菌丝生长及孢子萌发的作用效果不同，其中冈村凹顶藻粗蛋白对红色链孢霉菌丝的生长，羊栖菜粗蛋白对稻温菌孢子的抑制作用用最明显，而羊栖菜和铁钉菜粗蛋白对红色链孢霉的菌丝生长，冈村凹顶藻粗蛋白对绿色木霉及黄曲霉的孢子萌发均无抑制效果。对于海藻蛋白的抗菌机理还不清楚，还需要有更多的实验研究证明了解其作用机理。5 结语

22、及展望抗菌多肽因其独特的抗菌机制在工业、农业畜牧业及医药等方面具有广泛的应用前景，因为这些很多产抗菌肽的微生物都是从发酵食品中分离出来的或者是对人体无害的甚至是有益的，所以这些抗菌多肽作为添加剂添加到医药、食品中是安全的比很多防腐剂有效，而且其用量也很少，而且微生物抗菌多肽不容易使生物产生耐药性。对于抗菌多肽的研究还是需要进一步的深入，因为还有不少抗菌多肽的抗菌机理还不清楚，有待于科学研究的深入。相对于动物和植物抗菌多肽而言，微生物抗菌多肽的研究还比较落后。但是随着科学的发展，基因技术和细胞融合技术的成熟，必将为微生物抗菌多肽打开一个无限广阔的空间。参考文献：1 Marek Radyowski

23、, Syawomir Bartkowiak, Krystyna Winiarczyk, Andrzej Kalinowski. Differential influence of bacitracin on plant proteolytic enzyme activities J. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1722:1-5.2 Li-June Ming, Jon D. Epperson. Metal binding and structureactivity relationship of the metalloantibiotic pept

24、ide bacitracin J. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002, 91:46-58.3 Brewer G.A., Florey K., Anal. Profiles Drug Subst. 1980,9: 169. 4 Blas M, Briesacher K S,. Lobato E B. Anesth. Analg. 2000, 91:10271028.5 M.T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker, in: Brock Biology of Microorganisms, 8th Edition, Pr

25、entice Hall, Upper Saddle River, NJ, 1997, Chapter 3.6 E.P. Abraham, G.G.F. Newton, in: G.E.W. Wolstenholme, C.M. OConnor, CIBA Symposium on Amino Acids and Peptides with Anti-Metabolic Activity, Ciba, London, 1958, p. 205.7 薛志成.杆菌肽锌在畜禽饲养中的应用J. 养殖与饲料,2006,01: 23-24.8 Hiroo Y, Koji O, Kazuhiko T. Mod

26、e of antibacterial action by Gramicidin S J. Biochen, 1986, 100:1253-1259.9 Gause GF, Brazhnikova MG. Gramicidin S and its use in the treatment of infected wounds J. Nature, 1944, 154:703-709.10 Elmar J, Prenner, Ruthven NAH. The interaction of the antimicrobial peptide gramicidin S with the lipid b

27、ilayer model and biological membrane J. Biochim et Biophysi Acta, 1999, 1462:201-221.11 Yamada K, Unno M, Kobayashi K. Stereo-chemistry of protected ornithine side chains of Gramicidin S derivatives:X-ray crystal structure of the Bis-BOC-tetra-N-methyl derivative of Gramicidin S J. Am chem. Soc, 200

28、2, 124:12684-12692.12 Bulent GA, Muhammed G, Ferdie S. Thermodynamics study of gramicidin S and dipalmitylphosphatidylcholine model membrane interactions based on the FTIR spectroscopy J. Journal of Molecular structure, 2001,565:281-286.13 Hiroo Y, Makoto K, Naotomo T. Absorption of 14C-labeled Gram

29、icidin S on cell of Bacteria J. Biochem, 1981, 90:1087-1091.14 Gijsbert M, Grotenbreg, Emile S. Synthesis and biological evaluation of novel turn-modified gramicidin S analogues J. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2003,11:2835-28441.15 高向阳, 陈念, 林壁润. 短杆菌肽S的研究进展J. 生命科学与研究, 2004, 8(2):76-79.16 王狱,方金

30、瑞. 抗生素M. 北京:科学出版社,1988.17 邢维玲,周希贵,王贺祥.多粘菌素E高产菌株的选育J. 中国抗生素杂志, 2002, 27(6):326-328.18 Teube M. Lysozyme一dependent production of spheroplast-like bodies from polymyxin B treated samlonealla typhmiurium J. Acrh., Miocrbiol, 1970,70:139-146.19 Koike M. Iida K. Effect of polymyxin on the bacteriophage receptors of the cell walls of gram negative bacteria J. Bacetriol, 1971,108:1402-1411.20 Mannlkin D E. Lipids: complex lipids, there chemistry, biosynthesis and roles. In C. Ratledge and J. Stanford(ed.). The