微生物检验规范

1、微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。3.4品保微生物检验员负责出具检

2、测报告并作出符合性判定。3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实 验 器 材、培 养 基 和 试 剂 1 超净工作台 2 恒温培养箱 36±13 低温培养箱 25-28 4 恒温水浴锅 46±15电子/托盘天平（精确到0. 1g） 6 高压蒸汽杀菌锅7 烘箱 8 酒精灯9 记号笔 10打火机 11镊子 12药匙 13. 生物滤膜 14培养皿 9cm/6cm15. 锥形瓶 300ml/500ml+硅橡胶塞 16试管 17小发酵管 18试管架19接种环 20显微镜 21塑料篮子 22移液管 1ml、5ml、10ml 23. 膜过滤设备 2

3、4. 医用不锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂 1总菌数培养基 平板计数琼脂培养基 2大肠菌群培养基 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基 虎红培养基4氯化钠6乙醇7二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微 生 物 检 验 的 前 准 备 4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于 120干热灭菌120分钟后，调至 160-180干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。锥形

4、瓶及移液管的湿热灭菌 洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121湿热灭菌20分钟即可。4.2.1.3镊子、接种环等的火焰灭菌接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火焰上方；培养基容器口边在火焰上方。4.2.1.4化学灭菌（75%酒精、100×10-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×10-6 ClO2擦洗灭菌。4.2.2培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌4.2.2.1 0.9%生理盐水的配制称

5、取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可。.2 75%酒精的配制 取375ml无水酒精，则需加水375/0.75-375=125ml .3培养基的配制和灭菌条件测定项目培养基名称培养基量/1000ml蒸馏水杀菌条件菌落总数平板计数培养基23.5g121×15分钟大肠菌群结晶紫中性红胆盐琼脂41.5g煮沸灭菌2分钟大肠菌群煌绿乳糖胆盐40g121×15分钟霉菌酵母虎红培养基35g121×20分钟灭菌完全后的培养基置于46±1的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1方可用.4.2.2.4 湿热灭菌的步骤：（1）检查蒸压釜中有否足够的

6、水。（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否有松动。（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。（5）检查排气道或排气阀是否打开。（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。蒸汽要猛烈排放2-3min，以保证蒸压釜内冷空气全部排出。关闭通风阀或排气阀。（7）继续加热，至达到预定压力及温度。设备和培养基将在121下维持20min，以进行灭菌。所需压力要连续维持一定时间。（8）所需加热时间一过，停止加热。在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。否则不要打开蒸压釜。当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸

7、压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原载有的物品充分冷却。 （9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。灭菌完成后的培养基，温度降至46±1方可使用。所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。无菌室及超净台的灭菌.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用100×10-6 ClO2消毒桌面、地面。每月用2%过氧乙酸熏蒸。.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即

8、可进行实验操作。4.3.样品的抽样和判定标准实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。4.3.2样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准产品品项抽样频率检验项目检验方法检验标准检验时间550ml/1.25L天然水正常：1瓶/2小时/线开（关）机：2瓶/线细菌总数滤膜法50个/100ml恒温室放置2天后检验大肠菌群滤膜法不得检出霉菌酵母滤膜法20个/100ml细菌总数GB-478920个/ml霉菌酵母GB-47895个/ml备注：按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789，一半采用滤膜法。4.3.3

9、生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准线别监控点检验项目检验方法标准规定检验频率水处理源水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/周大肠菌群霉菌酵母砂滤出水，碳罐出水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/维护后大肠菌群霉菌酵母精滤出水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/天大肠菌群霉菌酵母RO膜系统出水菌落总数滤膜法10cfu/100ml1次/维护后大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml精滤UV后出水菌落总数滤膜法50cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母50cfu/100ml膜出水、

10、膜产水储罐、兑制水储罐、兑制水UV后、菌落总数滤膜法10cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落总数滤膜法3cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml水线灌装头（开机前）菌落总数霉菌酵母擦拭法2个/每灌装头1次/周灌装头5个/每灌装头洗瓶头（开机前）2个/每洗瓶头洗瓶头5个/每灌装头封盖头5个/10cm2盖滑槽5个/10cm2拨盖星轮5个/10cm2盖贮存槽5个/10cm2盖斗5个/10cm2盖输送带5个/10cm2洗瓶夹5个/10cm2门内壁20个/10cm2充填槽外壁或顶部20个/10c

11、m2风送轨道20个/10cm2输送带（接近灌装机）20个/10cm2冲洗后空瓶平均2个/瓶盖下滑道中盖平均2个/盖操作人员手部50个/双手操作人员衣服50个/10cm24.4微生物检测方法 滤膜法: 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。.1 仪器：冰箱：04；恒温培养箱：36±1/25-28；恒温水浴锅：46±1；电子天平：精确至0.1g；灭菌平皿:直径60mm或90mm；膜过滤设备；滤杯；0.45m滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。.2试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，0.9%生理盐水，121灭菌20min

12、；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。.3操作步骤:（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。（3）培养a.菌落总数：倒置于36±1的恒温箱中，培养48h±2h。菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28恒温箱中，3d后开始观

13、察，共培养观察5d。菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。c.大肠菌群倒置于36±1的恒温箱中，培养18h-24h。取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。例：在VR

14、BA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10/100ml=60cfu/100ml。国标法：适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。.1菌落总数.1.1设备与材料：冰箱：04；恒温培养箱：36±1；恒温水浴锅：46±1；电子天平：精确至0.1g；灭菌吸管；灭菌平皿：直径90mm或60mm；超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。.1.2培养基与试剂：平板计数琼脂培养基，0.9%生理盐水，121灭菌20min；75%乙醇；100×10-6 ClO2溶液。.1

15、.3操作步骤：（1）样品稀释及培养a.以无菌操作取样品。b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释

16、度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。及时将6-7ml或15-20ml冷却至46的培养基倾注入平皿。采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1恒温箱内培养48±2h。(2)菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。a.选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。b.其中

17、一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。c.当平板上出现菌藻间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。(3) 菌落总数的计算方法 a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。 b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：N=C/（n1+0.1n2）d 式中： N样品中菌落数； C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落

18、数之和； n1第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d稀释因子（第一稀释度）。 c.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 e.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 f.若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（4）菌落总数的报告 a.菌落数在1

19、00以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 b.大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。 c.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 d.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 e.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。 .2酵母和霉菌设备与材料：冰箱：0-4；恒温培养箱：25-28；恒温水浴箱：46±1；电子天平：精确至0. 1g；灭菌具塞锥形瓶：500ml；灭菌平皿:直径90mm或60mm；灭菌试管及其

20、它灭菌设备；.2.2培养基与试剂：虎红培养基，0.9%生理盐水，121灭菌20min，75%乙醇，100×10-6 ClO2溶液。.2.3操作步骤（1）样品稀释及培养a.以无菌操作取样品。b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。e.根据食品卫生标

21、准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。及时将6-7ml或15-20ml冷却至46的培养基倾注入平皿。采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。f.待琼脂凝固后，翻转平板，置于25-28霉酵培养箱中。3d后开始观察，共培养观察5d 。 (2)计算方法：通常选择菌落数在10-150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中含霉菌和酵母数，稀释度选择及菌

22、落报告方式可参考菌落总数的计数方法。(3)报告：每克（或毫升）样品中所含的霉菌和酵母菌数以cfu/g(ml)表示。.3大肠菌群.3.1设备与材料：冰箱：04；恒温培养箱：36±1；恒温水浴锅：46±1；电子天平：精确至0.1g；灭菌吸管；灭菌平皿：直径90mm或60mm；超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。.3.2培养基与试剂：煌绿乳糖胆盐（BGLB），0.9%生理盐水，121灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），煮沸灭菌2分钟；75%乙醇；100×10-6 ClO2溶液。.3.3操作步骤(1)样品稀释a.以无菌操作取样品。b.取样品25（g）ml加入到

23、225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白

24、对照。及时将6-7ml或15-20ml冷却至46的培养基倾注入平皿。采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。 (2)平板计数 a.选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。 b.及时将6-7ml或15-20ml冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆盖平板表层，翻转平板，置于36±1培养18h24h。（3）平板菌落的选择选取菌落数在30150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典

25、型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。（4）证实试验从VRBA平板上挑去10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种与BGLB肉汤管内，36±1培养18h24h，观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。（5）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（每毫升）样品中大肠菌群数。例：104样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g

26、(mL)=6.0×105(CFU/g)CFU/mL。附：大肠菌群检验程序 检样25g（25mL）样品+225mL稀释液，均质稀 释选择2个3个适宜稀释度的样品均液，接种VRBA平板36±1 18h24h计数典型和可疑菌落BGLB肉汤或复发酵试验 36±1 18h24h 报告4.4.3空气落菌检验 4.4.3.1设备与材料：恒温培养箱：36±1；霉酵培养箱：2528；电子天平：精确至0. 1g；灭菌平皿:直径90mm；高压灭菌锅及其它物品。4.4.3.2培养基与试剂：虎红培养基，平板计数琼脂培养基，121灭菌20min。4.4.3.3操作步骤（1） 在已经

27、过灭菌的培养皿中分别倾注已经过灭菌后的平板计数琼脂培养基和虎红培养基 ，静置使其自然凝固。（2）将已凝固的培养基正向放置于需检测空气落菌的地点，将培养皿的盖取下,盖口朝下,轻轻搭放在培养皿的边缘。（3） 将培养皿放置30分钟后，盖好培养皿盖取回，菌落总数平板倒放于36±1恒温箱中培养48h±2h，霉酵平板倒放于25-28低温培养箱中培养5天。（4）计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。4.4.4空气浮游菌检验 4.4.4.1设备与材料：浮游空气尘菌采样器；恒温培养箱：36±1；霉酵培养箱：25-28，电子天平：精确至0. 1g；灭菌平皿:直径90mm；

28、高压灭菌锅及其它物品。4.4.4.2培养基与试剂：虎红培养基，平板计数琼脂培养基，121灭菌20min。4.4.4.3操作步骤（1）在已经过灭菌的培养皿中分别倾注已经过灭菌后的平板计数琼脂培养基或虎红培养基，静置使其自然凝固。（2）将浮游空气尘菌采样器置于被测区域，打开采样盖，对采样盖进行擦拭消毒，将预先制备的平皿开口置于采样器上，盖上采样盖。设置采样的流量为50L。（3）采样结束后，打开采样盖取出平皿盖好。菌落总数平板倒放于36±1恒温箱中培养48h±2h，霉酵平板倒放于25-28低温培养箱中培养5天。（4）计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。4.4.5棉签

29、擦拭试验- 表面微生物评估4.4.5.1 仪器擦拭用棉签，0.9%生理盐水，121灭菌20min；酒精灯；75%酒精；记号笔；其它同菌落总数的检测方法。4.4.5.2 培养基与试剂平板计数琼脂培养基、虎红培养基 4.4.5.3操作步骤（1）将棉签和生理盐水121灭菌20min.（2）手经75%酒精消毒后,或戴用酒精浸泡过的手套持棉签的后端部擦拭； （3）擦拭：a.设备及其它平整的表面：用无菌棉签擦拭10cm2 面积的设备或其它平整的表面, 往返涂擦两遍，每擦拭一遍，将棉签转动一次。如检测表面狭长，可使其总面积达到10cm2，如所检测表面面积较小，可适当减少擦拭面积。b.灌装头或其它不规则表面：用无菌棉签擦拭灌装头表面，尽量擦拭整个灌装头,往返涂擦两遍，每擦拭一遍，将棉签转动一次。c.手部