结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物

1、结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究         11-03-25 16:00:00     编辑：studa20                    作者：吴媛，吴国球，刘乃,张松，张宇【摘要】  目的： 通过化学合成方法制作结缔组织生长

2、因子(connective tissue growth factor,CTGF)单克隆抗体超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)粒子分子探针，并检测其生物活性。方法： 采用EDC(1ethyl33dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride)化学连接剂将CTGF单克隆抗体与DMSAmeso2,3dimercaptosuccinic acid(HOOCCH(SH)CH(SH)COOH)修饰的USPIO相结合，形成具有免疫活性的分子探针。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及We

3、stern blotting方法检测其生物稳定性及免疫活性。结果： 随着加入不同质量的单克隆抗体，ELISA试验所得的吸光度值随抗体含量增加而增大，与阴性对照USPIO组相比较差异显著(P<0.05),分别间隔30 d及60 d后再次测量，只有200 g单抗组吸光度值降低(P<0.05)。Western blotting试验显示，结合单抗的USPIO及单纯单抗均显示出条带，且前者较浅，而单纯USPIO对照组则未显示条带。结论：EDC化学方法可制备出结缔组织生长因子单克隆抗体超顺磁氧化铁粒子，同时仍具有抗体的生物活性及生物稳定性。 【关键词】  超微超顺磁氧化铁; 结缔组织

4、生长因子; 单克隆抗体; 生物活性近年分子影像学应运而生,发展迅速，Weissleder等1将分子影像学定义为“在细胞和分子水平对生物学过程进行活体定性及测量的技术”。不断出现的各种分子探针，能观察代谢变化的分子成像技术，为阐明发病机制提供先进手段24。心血管系统的分子影像学探针的开发与应用体现出有用的价值,不同的靶向探针已开发用于不同的分子事件，如纤维蛋白、凋亡、血管生成等的成像56。超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)作为探针直径小，能穿行于血管内皮细胞间隙，可用于血管分子成像7。结缔组织生长因子(connectiv

5、e tissue growth factor，CTGF)在心血管疾病的发生、发展中起重要作用,与动脉粥样硬化8、心肌梗死9、高血压10、血管形成11有关;同时是一种特异性更强的、选择性干预病理改变过程的细胞因子。本实验将其单克隆抗体与USPIO通过化学方法相结合可以达到在活体水平动态观察及测量的目的，对于研究心血管疾病的发展及早期诊断有着重要的意义。1 材料与方法1.1 材料DMSA修饰的USPIO(东南大学生物科学与医学工程系制备);重组CTGF及CTGF单抗(本实验室制备);辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠抗体，Biomat高吸附酶标板(上海晶美公司);EDC(美国Sigma公司);全自

6、动洗板机(美国BioRad公司);蛋白质Marker(美国BioRad公司)，酶标仪(美国Sigma公司)。1.2 方法1.2.1 CTGF单克隆抗体超顺磁粒子的制备 采用东南大学生物科学与医学工程系合成DMSA修饰的USPIO，直径为1015 nm，质量浓度7.8 g·L-1。将其用去离子水冲洗3次，重悬于1 ml的PBS溶液中(0.1 mol·L-1，pH 5.6)，稀释至终质量浓度0.1 mg·ml-1，并经超声分散20 min。将新鲜配制的EDC溶液(10 mg·ml-1)加入USPIO的溶液中，在室温下轻晃5 min后再分别加入25、50、10

7、0、200 g的单克隆抗体，将上述溶液混匀，于室温下轻晃反应2 h。结合上单抗的USPIO用永磁铁从溶液中分离，并用PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)冲洗3次。将结合单抗及同质量未结合单抗的USPIO，加入含有1%BSA的PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液1 ml。37 孵育2 h后弃去溶液，再用PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)冲洗3次。最后重新悬浮于1 ml PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液中。1.2.2 ELISA试验 取一定量CTGF抗原，用pH 7.2 0.1 mol·L-1的

8、PBS稀释至适当浓度，包被96孔酶标板，100 l·孔-1，4 过夜。清洗3次后加入1%BSA的封闭液，200 l·孔-1，37 孵育2 h。清洗5次后分别加入结合上述不同浓度的单克隆抗体及未结合单抗的USPIO，50 l·孔-1，37 孵育1 h，清洗5次后加入一定稀释度的HRP标记的单抗，50 l·孔-1，37 孵育1 h。清洗5次后加TMB显色液A、B各50 l·孔-1，37 孵育15 min,加入终止液50 l·孔-1，测得各孔A450 nm/A630 nm。1.2.3 Western blotting试验 将CTGF及Mar

9、ker加入到样品孔中，通过SDSPAGE凝胶分离，然后转印至PVDF膜上,之后用PBST溶液(1Tween20,0.1 mol·L-1,pH 7.4)漂洗，室温下用含有5%脱脂奶粉封闭2 h。分别将结合单克隆抗体100 g的USPIO及未结合单抗的USPIO稀释10倍后与PVDF膜一起孵育，4 过夜。PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10 min。加入用PBST稀释的二抗，与膜共孵育，置于摇床室温2 h。用PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10 min。滤纸吸干膜上的水分，将膜移至干燥的保鲜膜上，ECL液均匀滴加在PVDF膜上，用保鲜膜包住PVDF膜，放在夹板上，剪一张稍大于PV

10、DF膜的胶片覆盖于膜，夹紧夹板，曝光后分别置于显影液、定影液中显影，即可观察条带。1.3 统计学处理用SPSS 15.0统计软件分析数据。计量资料以x-±s表示，统计分析采用oneway ANOVA进行显著性检验，若P<0.05则差异有统计学意义。2 结 果2.1 ELISA试验检测CTGF单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子及生物活性、稳定性 加入不同质量单克隆抗体(25、50、100、200 g)与USPIO(0.1 mg)反应后，所得生成物于波长450 nm/630 nm处测得各浓度吸光度值分别为0.517±0.128、0.891±0.194、1.185

11、±0.122、1.633±0.048。经统计学分析，PBST组与单纯USPIO对照组相比无显著差异(0.057±0.013 vs 0.088±0.020，P>0.05);单纯USPIO对照组与不同质量各组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。不同质量单克隆抗体(25、50、100、200 g)与USPIO(0.1 mg)反应后生成物，于PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液中4 保存30 d及60 d后，再次洗涤3次并重悬浮于1 ml PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液中，于波长450 nm/630 nm处测得各浓度吸光度值，并求其平均值(n=3)，结果如图1。200 g组0、30、60 d间吸光度值比较明显降低，差异显著(P<0.05)，其余各组0、30、60 d间吸光度值比较无显著差异(P>0.05)。2.2