呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒感染硕士论文

1、呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗的初步研究摘要 4-5 Abstract 5-6 插图和附表清单 10-11 缩略语索引 11-12 第一章 呼吸道合胞病毒及F蛋白的相关研究 12-26 1.1 呼吸道合胞病毒的研究 12-16 1.1.1 RSV的发现史 12 1.1.2 RSV的发病率和流行性 12-13 1.1.3 RSV特征和结构研究 13-14 1.1.4 RSV感染及机体的免疫反应 14-15 1.1.5 RSV的检测方法 15-16 1.1.6 RSV引起的相关疾病 16 1.2 RSV F蛋白及RSV疫苗研究 16-21 1.2.1 F蛋白作用 16-17 1.2.2 F蛋白结

2、构 17-19 1.2.3 RSV疫苗研究 19-21 1.3 RSV疫苗佐剂和动物模型 21-23 1.3.1 RSV疫苗佐剂 22 1.3.2 动物模型 22-23 1.4 RSV感染的预防及治疗 23-25 1.4.1 RSV预防 23 1.4.2 RSV治疗 23-25 1.5 结束语 25-26 第二章 前言 26-28 第三章 F2基因的克隆 28-40 3.1 材料和方法 28-35 3.1.1 材料 28-32 3.1.2 方法 32-35 3.2 结果 35-37 3.2.1 Hela细胞培养 35 3.2.2 RSV培养 35 3.2.3 RNA提取结果 35-36 3.2

3、.4 F2基因扩增 36-37 3.3 讨论 37-39 3.3.1 细胞和病毒的培养 37 3.3.2 RNA的提取 37-38 3.3.3 RSV F2蛋白和基因引物设计 38-39 3.4 小结 39-40 第四章 表达载体F2/pGEX-6p-1的构建 40-54 4.1 材料和方法 40-47 4.1.1 材料 40-41 4.1.2 方法 41-47 4.2 结果 47-51 4.2.1 菌落PCR鉴定F2/pMD18-T/DH5 47 4.2.2 重组质粒F2/pMD18-T酶切鉴定 47-48 4.2.3 测序结果 48-49 4.2.4 菌落PCR鉴定F2/pGEX-6p-1

4、/DH5 49-50 4.2.5 重组质粒F2/pGEX-6p-1酶切鉴定 50-51 4.3 讨论 51-54 4.3.1 表达系统的选择 51 4.3.2 载体的选择和构建 51-52 4.3.3 测序结果分析 52-54 第五章 目的蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 54-68 5.1 材料和方法 54-62 5.1.1 材料 54-58 5.1.2 方法 58-62 5.2 结果 62-65 5.2.1 目的蛋白的表达 62 5.2.2 Western Blotting检测重组蛋白 62-63 5.2.3 目的蛋白的表达形式确定 63-64 5.2.4 目的蛋白的纯化 64-65 5.3

5、讨论 65-67 5.3.1 表达宿主的选择 65 5.3.2 目的蛋白的表达形式 65 5.3.3 目的蛋白的纯化 65-67 5.4 小结 67-68 第六章 目的蛋白免疫原性的测定 68-80 6.1 材料和方法 68-72 6.1.1 材料 68-69 6.1.2 方法 69-72 6.2 结果 72-77 6.2.1 蛋白定量结果 72 6.2.2 小鼠血清F2蛋白特异性IgG检测 72-73 6.2.3 小鼠血清F2蛋白特异性IgG1检测 73 6.2.4 小鼠血清F2蛋白特异性IgG2a检测 73-74 6.2.5 IgG1/IgG2a结果 74-75 6.2.6 小鼠血清F2蛋

6、白特异性IgA检测 75 6.2.7 小鼠呼吸道粘膜F2蛋白特异性IgA检测 75-77 6.3 讨论 77-79 6.3.1 疫苗佐剂的选取 77 6.3.2 疫苗的免疫原性初步评价 77-79 6.4 小结 79-80 第七章 全文总结 80-81 第八章 展望 81-82 致谢【学科专业名称】 微生物学 【学位年度】 2009 【论文级别】 硕士 【关键词】 呼吸道合胞病毒(RSV); F2亚单位; LT; 免疫原性; 【英文关键词】 Respiratory syncytial virus; F2 subunit; LT; Immunogenicity; 【中文摘要】 呼吸道合胞病毒(R

7、espiratory syncytial virus,RSV)是世界范围内普遍引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体之一,几乎95%的幼儿在两岁之前都感染过RSV,还可以引起毛细支气管炎、肺炎、支气管炎。自从该病毒发现以来,虽然在RSV疫苗研制方面取得了一定效果,但目前还没有一种完全安全、有效的疫苗问世。 本论文在原核细胞中表达了RSV的一种包膜蛋白F的F2肽段,并探索了所表达的F2蛋白的免疫原性。 为了克隆F2蛋白基因和表达F2,在Hela细胞中培养RSV,病变达到80%以上时提取总RNA,用反转录PCR获得F2蛋白基因。将F2基因插入pGEX-6p-l载体,重组表达载体F2/pGEX-6p-l

8、在大肠杆菌Rosetta中正确表达出了GST-F2蛋白,以包涵体的形式存在,表达量不足总蛋白的10%。通过对包涵体提取和洗涤,GST-F2蛋白可以占到50%。对包涵体变性、复性及使用GST亲和层析纯化,融合蛋白纯度达到85%。 为了测定原核所表达的F2蛋白的免疫原性,36只实验小鼠分为6组,分别在0、2、4周免疫小鼠, A：PBS组；B：LT(大肠杆菌不耐热肠毒素,LT)组；C:GST. 【英文摘要】 Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the major pathogens of lower respiratory tract infection in infants worldwide. Almost 95% children are infected before age of 2, cause bronchiolitis, pneumonia, bronchitis. Since the virus was found, some RSV vaccine has been developed, However, a completely safe and effective vaccine is not available yet. In this study, we