基层兽医实验室开展禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验出

1、基层兽医实验室开展禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验出现的误差分析与探讨南金鱼（酒泉市畜牧服务中心 甘肃 酒泉 735000）酒泉市肃州区南环西路20号摘要：禽流感血凝（HA）和血凝抑制(HI试验是禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。近年来，随着动物疫病防控形势的需要，禽流感疫病的日常监测、集中监测和免疫抗体检测工作量逐年增加，禽流感血凝（HA）和血凝抑制(HI试验成为当前基层兽医实验室检测禽流感的唯一技术方法，其试验结果的准确性直接影响着重大动物疫病防控策略的制定。通过开展基层兽医实验室比对试验发现影响禽流感血凝（HA）和血凝抑制(HI试验的因素诸多，分析实验结果和关键操作步

2、骤，总结试验误差，归纳出从试剂配制、器材准备和操作规范三方面改进完善试验。关键词：禽流感；血凝抑制；结果误差；分析与探讨禽流感血凝（HA）和血凝抑制(HI试验是禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。近年来，随着动物疫病防控形势的需要，禽流感疫病的日常监测、集中监测和免疫抗体检测工作量逐年增加，禽流感血凝（HA）和血凝抑制(HI试验成为当前基层兽医实验室检（监）测禽流感的唯一技术方法，其试验结果的准确性直接影响着重大动物疫病防控策略的制定。为探索试验操作技巧、提高实验结果准确性，我们对同1组（9份）血清在7个县级兽医实验室（实验室名称在下文分别以A、B、C、D、E、F、G代替）开展了抗体

3、检测比对试验，发现在不同的实验室、不同的人员操作下出现不同的结果。根据此次比对试验，笔者对影响基层兽医实验室开展禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验结果准确性的因素进行了简单分析讨论，以供同行参考。1.试验方法1.1检测样品：血清样品1组（共9份，已知抗体滴度），根据实验需要将每份血清分成等量的若干小份（每小份不少于0.5ml）共50份，并重新编号后，随机组合成7组血清盲样（每组10份血清，其中有3-4份重复）（血清盲样分配见表一）。1.2诊断试剂：同一生产批号的（哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号分别为200901和200801）禽流感H5(HI标准抗原和标准阳性血清各7份（诊断试剂分

4、配见表一）。1.3材料准备： 96孔900和1100V型微量反应板和不同型号微量移液器数把（配有滴头），各实验室自行准备。1.4检测步骤：按照高致病性禽流感诊断技术（GB/T189362003）要求操作（具体步骤略）。p 样品分组编号情况(表一p 样品编号分组后盲样编号p ABCDEFGp 17511101p 21,51088326p 324789p 484597p 51936p 68,101071p 7936215p 83246710p 94,6,7,93,5,61,2,6,72,9,104,5,8,103,5,92,3,4,8p 标准抗原1份1份1份1份1份1份1份p 阳性血清1份1份1份

5、1份1份1份1份p 合 计12份12份12份12份12份12份12份禽流感(HI检测结果分析（表二）样品编号标准滴度各实验室检测结果检测次数与标准滴度相比ABCDEFG相同滴度出现低一滴度出现高一滴度出现出现其他结果次数比例次数比例次数比例次数比例1282828272729276233%350%117%00%2262725272026202107114%114%229%343%327202827272105240%0%120%240%4210210210210282105480%0%0%120%526262920284125%0%0%375%625202520204125%0%0%375%72

6、62026202520206117%117%0%467%8210272102820282106233%0%0%467%92020202020202020771000%0%0%合格率60%90%90%30%70%50%60%502142%510%48%2040%2.结果分析2.1数据分析：50份血清盲样中，各实验室检测滴度与标准滴度完全一致的有21份，占检测数的42%；检测滴度比标准滴度低一个滴度的有5份，占检测数的10%；检测滴度比标准滴度高一个滴度的有4份，占检测数的8%；出现其他较大差距滴度的有20份，占检测数的40%；按照正常误差为±1个滴度的标准计算，此次比对试验检测合格30

7、份，占检测数的60%。试验结果用SPSS软件进行方差分析，表明差异显著（P>0.05）。2.2误差分析：此次试验中，血凝（HA）试验即4倍（HAU）抗原配制在7个实验室出现了4种配制比例。A和G实验室在第6孔（1:64）出现完全凝集、B和C实验室在第8孔(1:256出现完全凝集、E和F实验室在第10孔(1:1024出现完全凝集、D实验室在第9孔(1:512出现完全凝集，并且7个实验室均在做血凝抑制（HI）试验前未做4倍（HAU）抗原的回归试验。分析得出，未充分校正4倍（HAU）抗原的准确性是导致试验结果误差较大的主要原因。按照试验要求，鸡红细胞必须来自3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗

8、体的健康公鸡。由于基层兽医实验室无SPF动物，该试验中7个实验室所用红细胞均采集于眼观健康公鸡。不能排除带有禽流感和新城疫等抗体的公鸡红细胞在凝集反应中的影响。型微量反应板：凝集反应过程及结果观察均离不开V型微量反应板，反应板的透明度、孔内壁的光滑度以及清洁度都对凝集反应有着不可忽视的影响。7个实验室在该实验中采用的全是多次使用过的微量反应板，磨损程度和清洁程度差异较大，且A、B、C、D和E5个实验室在血凝（HA）和血凝抑制(HI试验中全采用的是1100V型微量反应板，F和G两实验室在试验中混用900和1100V型微量反应板。分析得出，不同角度V型微量反应板和陈旧反应板的使用对该实验结果的准确

9、性也产生了一定的影响。3.讨论与建议目前，我市县级兽医实验室为最底层实验室。由于受建设标准低、人员学历和业务水平不高等因素的影响，禽流感血凝(HA和血凝抑制(H1等试验在基层实验室开展中不同程度的存在着结果误差大的现象，为提高试验准确性，有效避免非正常误差的出现，建议从以下三点进行完善：3.1试剂配制:禽流感血凝(HA和血凝抑制(H1试验中自行配制或调制的试剂有pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、阿氏（Alsevers）液、1%鸡红细胞悬液和4倍（HAU）抗原配制等4种之多，且每一种试剂在配制和保存过程中的精确度要求高是基层实验室在该实验中出现误差较大的主要原因，建议在禽流感血凝(HA和血凝抑制(H1试剂诊断合中增加统一配置的有关试剂，如高度浓缩的软胶囊制剂、固体颗粒等，减少现场配置操作，提高实验操作准确性。3.2器材准备：试验器材中自行准备主要的是V型微量反应板和微量移液枪（滴嘴），反应板的磨损和清洁程度在一定程度上影响试验结果的准确性。建议在禽流感血凝(HA和血凝抑制(H1试剂诊断合中增加一次性V型微量反应板或试验室及时淘汰陈旧的反应板和滴嘴，至于900和1100V型微量反应板在实验中的影响需做更详细的进一步论证。3.3规范操作：操作失当是人为导致试验结果误差较大或结果错误的主要原因。试验操作中不仅要严格按照高致病性禽流感诊断技术（G