基于ImageJ软件的水稻根毛长度测量

1、基于ImageJ软件的水稻根毛长度测量-农学论文基于ImageJ软件的水稻根毛长度测量付艳茹，须健(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉4 3 0 0 7 0 )摘要：以体视镜拍摄的水稻(Oryza sativa)中旱5号(Z H 5 )和珍汕97 (ZS97)的主根照片为研究对象，利用图像分析软件ImageJ建立了一种全新的水稻根毛长度测量方法。在不同的培养时间和培养条件下，分别对位于水稻主根不同部位根毛的长度进行统计，得到一组最优的水稻根毛的测量方法和测量条件。用所建立的水稻根毛长度测量体系，对两组肉眼观察根毛长度无明显差异的水稻品种进行了测量，结果表明，此种方法可以检测出两个水稻

2、品种间根毛长度的差异。关键词：水稻(Oryza sativa);根毛；长度测量；I m a ge J软件中图分类号：S 5 1 1 ; TP 3 9 1文献标识码：A 文章编号：0439 8 114 ( 2 0 15) 07 1722-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.07.049水稻是单子叶植物的模式植物，也是重要的粮食作物。目前对于水稻地下部分的研究相对薄弱。根系是植物吸收外界水分、养分的主要器官，环境条件和栽培 措施大多是首先通过影响根系的发育，进而影响到植株地上部分的生长。根毛是 根的成熟区表皮细胞的细长突起。大部分被子植物的表皮细胞分为生毛细胞

3、 (H 细胞)和非生毛细胞(N细胞)。以前一直认为水稻根毛是由表皮细胞不对称分 裂后形成小的子细胞分化产生的，但近期的研究表明水稻根的表皮细胞是对称分裂的，根毛发达后生毛细胞比非生毛细胞的扩增速率快，导致根毛成熟时生毛细胞比非生毛细胞要小。生毛细胞比非生毛细胞的扩增速率快可能与生毛细胞是重 要的吸收水分和营养的器官有关1 0Image J是由美国国立卫生研究院 (N ational Institu tes of Health)开发的一个基于J AVA的图像处理软件， 可以显 示、编辑、分析、处理多种图片格式，由于其操作简单有效已经广泛地应用于各 个领域2 4 。本研究利用Image J软件首次

4、建立了水稻根毛长度的测 量方法，使准确、简便地量化水稻根毛的长度成为可能； 利用所建立的根毛测量 方法对两组肉眼所见根毛长度无明显差异的水稻品种进行测量，发现此种方法可以揭示出不同水稻品种间根毛长度的差异，从而证明了该测量体系的可行性和有 效性，为进一步研究水稻根毛发育及其影响因素打下了量化分析基础。1 材料与方法1 . 1 材料水稻：中旱5号(Z H 5 )、珍汕9 7 ( Z S 9 7 ),由华中农业大学作物遗传 改良国家重点实验室提供。1 . 2 方法1) 1/2 MS培养基配制。培养基配方为：2.2 g MS粉末、10 g 蔗糖、0.5 g MES (2- (N-吗啡咻)乙磺酸)、1

5、 0 g琼脂，去离子水 定容至1 L。调节pH至5. 8,高温高压灭菌15 min后倒入 13 cm X 1 3 c m透明的塑料方形培养皿中，凝固后备用。m : V)2)种子灭菌及幼苗生长。将去掉颖壳的水稻种子分装在锥形瓶中，加入适量 7 5 % (V/V)的乙醇摇晃1min,弃去乙醇，加入0 . 1 5 % (升汞摇晃1 5 min,弃去开汞，最后用灭菌水清洗35次。将灭过菌的水稻种子横向（胚背向培养基一侧）摆放在1/2MS培养基上，每皿1 0粒。将培养皿封口后竖直向后倾斜1 5 °2 0。放置，使根能贴在培养基表面生长。2 8 C光/暗（16h/8 h）培养或 2 8 C暗培养

6、2 d或3 d。2 结果与分析2 . 1 水稻根毛的图像采集去掉水稻幼苗培养皿封口膜后背面朝上， 用体视显微镜（Leica S 8 A PO; CCD: DFC2 90）拍照，参数设置为：1 X、曝光4 4 0. 3、饱 和度0 . 8 5、伽玛1 . 8 4、增益1 . 8 4 Xo2 . 2 水稻根毛的测量启动Image J软件，选择F i 1 e - Open （图1A）打开所拍摄的水稻主根的体视镜图片；Analyze-SetMeasurements（图1 E）确定标尺；选择Rectangular Selection工具（图1 B）,默认设置，将所需测量的部位选定，按键盘上的“C t r

7、 1 +C”键，将所选区域复制，File - N eInternal Clipboar d ,所复制的区域会作为一个独立的窗口出现；用F reehan d工具，默认设置，将主根选中（图1 C ）,选择Ana 1 y z e - M easure （图1D）得到主根的面积；选择Image - Type 8 bit （图IF）将图 像调整为灰度模式；选择Image-Adjust-Threshold（图1 G）通过拖动标杆（图1 H）将根毛和主根选中，然后选择A p ply,选择 Ana 1 y z e - A nalyze Particles （图 II）会弹出 个 设置框，调整 Size （pi

8、xel2） 1, Show - Out lines 一OK,这时会输出根毛和主根的面积和（图1 J）。根据公式：根毛的平均长 度=（根毛和主根的面积和主根的面积）/ （2 X所选区域的长度） ，得到根 毛的平均长度。2 . 3 水稻根毛测量方法的优化以ZH5和ZS 9 7为材料，选取尖端（从距根毛起始处1mm开始向上4mm的区域，图2 A白色箭头区域）、基部（从种子端开始向下4 mm的区域， 图2 B）和整体（基部和尖端根毛的平均值）的根毛长度进行统计。培养条件和 时间也做了相应的改变，2 8 C光/暗（16h/8 h）培养或2 8 C暗养 2 d 或 3 do2.3.1 培养条件的确定 在光

9、、暗条件下培养2 d,分别对根的尖端、 基部和整体的根毛长度进行测量。 结果表明，在光、暗条件下ZH5和ZS97 两个品种间各个部位的根毛长度差异都极显著， 但在光培养条件下两个品种间尖 端、基部、整体的P值（分别为4 . 00E 11、4. 06E08、3. 1 3 E 1 2 ）远小于暗培养下两个品种间的P值 （分别为5. 3E04、2.2 5E03、9.2E04）,所以选定光培养为进行根毛长度测量的理想条 件。2.3.2 培养时间的确定 分别光培养2 d和3 d,对根的尖端、基部 和整体的根毛长度进行测量。结果表明，光下培养2 d和3 d时，ZH5和Z S 9 7两个品种间各个测量部位的

10、根毛长度差异都极显著；但在光培养2d时Z H 5种内也有显著性差异（基部的根毛长度和整体的根毛长度相比其P值为 0. 0 3 9 ）,表明光培养2 d时根毛的长度尚未稳定，所以选定3d为测量根毛长度所需的培养时间。2.3.3 测量部位的确定 光培养3 d,ZH5和ZS97种间根毛长 度相比，各部位相比差异都极显著，尖端（P值为1 . 1 9 4 E 1 2）的差 异比整体（P值为6. 783E09）和基部（P值为3 . 1 2 6 E 0 5 ） 的要更为显著（图3 ,表1 ） ; Z H 5和Z S 9 7种内根毛长度相比，尖端和基 部的根毛长度与整体相比差异都不显著（表1）,所以可以用尖端

11、的根毛长度来 衡量水稻根毛的长度。由上述结果可以得出，水稻根毛长度测量体系的条件为：水稻光培养3d,以尖端根毛的长度来衡量整体根的根毛长度。2.3.4 . 4 水稻根毛测量方法的应用为了验证上述所建立的根毛测量体系是否切实可行， 对图4中肉眼所见根毛长 度无明显差异的两个水稻品种根毛长度进行了测量，其中A、B、C为同一品种，D、E、F为另一品种。结果显示，图4 AF的水稻根毛长度分别为1 4 4.5 95、1 7 2. 804、1 9 7. 843、297. 648、351. 781、 4 0 5.1 5 6皿1。统计分析结果表明，A、B间P值为2 . 4 1 8 E- 03, B、C 问P

12、值为 2. 74E02, A、C 问 P值为 1. 14E06, D、E 间 P值为 1 . 2 5 E 0 2 , E、F 问 P值为 4 . 06E02, D、F 问P值为2 . 7 4 E 0 5 ,这两组内3个样本问根毛长度的差异都是显著的， 从而证明了所建立的根毛长度测量体系可以用于根毛长度的量化分析，能快速准确地检测出各水稻品种间根毛长度的差异。3 小结与讨论根毛的长度决定了根和根际接触的面积大小，进而对根吸收水分和营养有重大 的影响。关于根毛初始和伸长的基因已经有相关的报道， 在水稻中O s C S LDl、OsAPY、 RHL1参与根毛的伸长。 根毛的初始和伸长都需要细胞壁松

13、弛蛋白EXP s o EXP有两个亚家族EXPA和EXP B , 有很多EXPA和 EXP B成员已经证实在细胞壁松弛和快速扩张中起重要的作用5 10。随着相关基因的分离，为进一步研究水稻根毛发育的分子机制奠定了基础。由于根毛是根成熟区表皮细胞的细长突起，很容易受到损坏。水稻植株较大， 根毛密集，所以对水稻根毛长度的测量有一定的难度。 试验采用在培养皿中生长 的水稻幼苗作为根毛测量的对象，不仅容易控制而且结果稳定可靠。虽然以前也 有研究测量过根毛的长度，但都是取根的特定部分的若干根毛，测量其长度作为 根毛的长度10,其测量的长度有时不能代表整个根的根毛长度。而该研究 采用软件统计的方法建立了一

14、个新的水稻根毛长度的测量方法，用所选区域根毛长度的平均值来衡量整体根毛的长度， 使得到的数据更有说服力。创建的基于I mage J软件的水稻根毛长度测量方法，使对水稻根毛长度的精确量化分析 成为可能，将有助于水稻根毛发育相关基因的发现及其功能研究，进一步推动水稻水分、养分吸收研究的发展。参考文献：1 KIM C M, DOLAN L. Root hair develo pment involves asymmetric cell divis ion in Brachypodium distachyon and sy mmetric division in Oryza sativa J. N e

15、 w Phytologi st, 2 0 1 1, 192 (3):6 0 1 6 1 0.2刘 智，王玲玲，周卫东，等.用I m a g e J分析水稻胚乳淀粉粒 表面几何特征的方法J .电子显微学报，2011,30 (4 5):466 一 4 7 1.3邓林红，王 锐，陈园园.基于电子扫描的I m a g e J图像处理系 统在多孔材料中的应用J .传感器与微系统，2012,31(5) :150 15 2.1 戴志聪，杜道林，司春灿，等.用扫描仪及Image J软件精确测 量叶片形态数量特征的方法J .广西植物，2 0 0 9, 29 (3) : 342 3 4 7.5 I SHIDA T

16、, KURATA T, OKADA K,et al. A genetic regulatory network in the dev elopment of trichomes and root hairs J. Annu Rev Plant Biol, 2 0 0 8, 59: 3 6 5 3 8 6.6 CHO H T, COSGROVE D J. Regulation o f root hair initiation and expansin g ene expression in Arabidopsis J. Plan t Cell, 2 0 0 2, 14 ( 1 2 ) : 323

17、7 3253.7 KIM DW, LEE S H, CHOI SB,et al. Fu nctional conservat ion of a root hair cell specific cis element in angiosp 6rms with different root hair distrib ution patterns J . Plant Cell, 2 0 0 6,18 (11):2958 2970.8 KIM CM, PARK SH,JE B I,et al.OsCS LD1, a cellulose synthase 1 ike DI gen e , is required for root hair mo rphogen esis in rice J. Plant Physiol, 2007, 1 43 (3): 1 2 2 0 - 1 2 3 0.9 WON S K, CHOI S B, KUMAR I S,