隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究

1、隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究                作者：谷明莉，钱琤，周晔，陈波，陈孙孝，邓安梅，仲人前  【摘要】  目的 探讨纯化的隐球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型隐球菌疫苗的研制打下基础。方法 通过细胞增殖和细胞毒性实验，研究纯化的GMFDGLSG

2、V单体、二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多聚体的免疫原性。结果 10例HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07；增殖反应明显高于四聚体（平均SI为20.1±1.37）、二聚体（平均SI为14.1±1.06）、单体（平均SI为11.4±0.68）以及阴性对照（平均SI为1±0.10）引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在抗原肽诱导的CTL细胞毒活性中，HLAA*0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照组均表现不同程度

3、的杀伤活性，平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1(P<0.01)。结论 本研究得到的重组优化八聚体具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性，为进一步开发有效的隐球菌疫苗打下了基础。 【关键词】  结核分枝杆菌 多聚体 疫苗Investigation of Immunogenicity of Multimer Peptides from MtbAbstract： Objective  To investigate immun

4、ogenicity of multimer peptides from mycobacterium tuberculosis (Mtb).Methods  Cellular proliferation and cytotoxicity experiments were performed to evaluate the immunogenicity of recombinant multimer peptides from Mtb. Results  Multimer peptides (10 ) could stimulate proliferation of perip

5、heral blood monocytes (PBMCs) from all of 14 HLAA*0201 positive (A2+) PPD+ healthy candidates, strikingly stronger than those of single peptides and PPDs groups (average stimulation index as 37.4±3.07 versus 20.1±1.37 or 14.1±1.06 or 11.4±0.68 or 1±0.10, respectively, P<0

6、.01). CTLs induced by multimer peptides were used as effector cells in a CTL assay against T2 cells loaded with single peptide (10 ). Multimer peptides could induce CTL cytotoxic activity in all of the 14 A2+PPD+ healthy candidates, significantly stronger than single peptides and PPDs groups (averag

7、e activity as 48.1±8.9% versus 23.9±9.2% or 16.3±7.8% or 13.1±8.4% or 1±10%, respectively, P<0.01). Conclusion  The recombinant octamerous peptide from Mtb can stimulate greater proliferation and cytotoxicity of PBMCs, which is helpful for designing new vaccine.Key&#

8、160; words： mycobacterium tuberculosis; multimer peptide; vaccine在隐球菌感染中，隐球菌性脑膜炎的发病率近年来呈现出逐年上升的趋势，且易发于细胞免疫功能受损的人群12。由于其病状重、病死率高等特点，已引起临床医生的高度重视。在艾滋病患者中，并发新生隐球菌感染率高达30%，是爱滋病患者最主要的死亡原因之一3。长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂和患癌症的病人隐球菌的感染率也在急速攀升4。虽然抗隐球菌的保护性免疫机制目前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞免疫起重要作用56。体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特

9、异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此PBMCs对隐球菌抗原的应答，可作为研究抗隐球菌保护性免疫的良好模型。HLAA*0201在多数人群中普遍存在，其频率>40%。因此，进行隐球菌抗原HLAA*0201限制性T细胞表位疫苗的研究具有重大的现实意义78。本研究采用HLAA*0201阳性个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性，探讨纯化的隐球菌抗原肽重组多聚体激发CTL免疫应答的能力，为抗隐球菌疫苗的设计打下基础。为了更加有效地达到预防和治疗目的，我们设计了含有可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采取了高尔基体内固有肽酶furin识别

10、序列作为表位接头的“串珠式” GMFDGLSGV多聚体6。1  材料与方法1.1  研究对象  10例HLAA*0201阳性志愿者，10例HLAA*0201阴性志愿者，留取外周血20 ml，肝素抗凝。1.2  试剂和试剂盒  FITC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLAA2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品；时间分辨荧光DELFIA细胞增殖（AD0200）与细胞毒性（AD0016）检测试剂盒均购自Wallac Oy公司；HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒购自One Lamda公司； LPS、人重组IL2、人重组GMCSF、人重组IL4购自R&

11、amp;D公司； T2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。1.3  重组表位肽的制备  选取隐球菌抗原表位GMFDGLSGV，引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR)，并以RVKR序列作为接头，分别合成隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列，经 PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX4T1，将重组质粒转入大肠埃希菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲合层析柱纯化，得到重组表达蛋白，方法参见文献9 182185。1.4  HLA分型  先以鼠抗人HLAA2单克隆抗体（BB7.2）进行HLAA2流

12、式细胞仪初步筛选，然后再以HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒进一步确认其A*0201亚型。1.5  抗原肽诱导CTL制备  用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，种于6孔细胞培养板，在含10%FCS的RPMI1640培养基中，37 5%CO2孵育1.5 h。收集悬浮细胞，以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GMCSF(1 000U/ml)、IL4(1 000 U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37 5%CO2培养7 d 促其转化，需要时补充新鲜培养液。5 d 后，加入LPS(1g/ml)

13、培养2 d 后促进DC成熟，照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多聚体、HLAA*0201阳性(10 mol/L)在培养液中，37 5%CO2共孵过夜。分别将1×105负载的DC与1×106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1640完全培养液的24孔细胞培养板，37 5%CO2混合培养3 d 后，加入rIL2(20 U/ml)继续培养10 d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。1.6  细胞增殖实验   细胞增殖实验采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒。分别将经辐射的5×103负载的APC 100 l 与5