三氧化二砷抑制口腔鳞癌细胞增殖的研究

1、    三氧化二砷抑制口腔鳞癌细胞增殖的研究        摘要：目的：体外试验研究三氧化二砷对口腔鳞癌的可能治疗作用。方法：以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞为研究对象之一，采用台盼蓝拒染法计数活细胞，观察三氧化二砷作用于Tca8113细胞的量效关系、时效关系。采用平皿法姬姆萨染色观察三氧化二砷对Tca8113细胞的克隆形成抑制作用。以舌鳞状细胞癌临床新鲜标本组织块为研究对象之二，消化后细胞悬液与各浓度三氧化二砷、一定浓度的MTX、5-Fu、PYM体外培养后MTT法测

2、定临床舌癌细胞生长抑制率。结果：三氧化二砷对Tca8113细胞、临床舌癌细胞均有显著生长抑制作用。1mol As2O3台盼蓝染色活细胞计数Tca8113细胞生长抑制率28.57%，克隆形成抑制率31.01%;3mol As2O3浓度Tca8113细胞生长抑制率58.36%，克隆形成抑制率76.63%;5mol As2O3浓度Tca8113细胞生长抑制率86.03%,克隆形成抑制率91.30%。体外药敏测定：1mol浓度As2O3的临床舌癌细胞的生长抑制率39.5%，3mol浓度As2O3为47.2%，5mol浓度As2O3为89%，MTX为36.5%，5-Fu为41.3%，PYM为58.16%

3、。临床药敏标准一般大于30%为敏感，PYM大于50%为敏感。结论：体外试验表明三氧化二砷可显著抑制人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞的生长，对临床癌细胞也表现了良好的抗增殖作用，三氧化二砷可能成为治疗口腔鳞癌的有效药物。关键词：砷剂；口腔鳞癌；药物敏感性试验中分类号：R739.8文献标识码：A文章编号：1005-4979(1999)03-222-03 PRELIMINARY STUDY OF ARSENIC TRIOXIDE IN THE TREATMENTOF ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMAWANG Yue-ping, ZHU Han-guang, ZHANG

4、zhi-yuan et al.The Ninth hospital Shanghai second University. Shanghai 200025;Abstract: Objective： To explore the possible anticancer effect of arsenic trioxide (As2O3) on oral cancer in vitro.Methods： Tongue squamous cell carcinoma cell Tca8113 and cells isolated from clinical tongue squamous cell

5、carcinoma specimen was used in vitro studies. The anticancer effect of As2O3 on oral carcinoma cell cancer was studied by MTT Assay and human tumor colony Assay (HTCA).Results： As2O3 obviously inhibited the growth and survial of Tca8113 and Tongue cancer ell. The tumor inhibition rate (TLR) was 86.3

6、% and the tumor colony forming inhibition rat was 91.3% for the Tca8113 with 3umol As2O3. The drug sensitity of antitumor drugs was 47.2% with 3umol As2O3、36.5% with the MTX、41.3% with the 5-Fu and 58.6% with the PYM for cells isolated from the tongue carcinoma specimen. Conclusion: The As2O3 might

7、be one efficient drugs in the treatment of oral squamous cell carcinoma in vitro study.Key words: Arsenic; Trioxide squamous cell carcinoma; Oral anticancer drug sensitivity三氧化二砷是最早用于治疗恶性肿瘤的化疗药物之一，在近一个世纪的研究中，三氧化二砷既作为毒物致死人命，又被认为是恶性肿瘤的诱导剂，特别象是肺癌和皮肤癌的致癌物。近来，三氧化二砷用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了显著的疗效，对其机理的研究表明三氧化二砷是一种

8、凋亡诱导剂和增殖抑制剂，其对其它恶生肿瘤的作用即抗瘤谱还不清楚。本研究对三氧化二砷在口腔舌鳞癌中的抗增殖作用进行了初步探讨，现报导如下：材料和方法1材料1.1舌癌细胞：采用人舌癌细胞系Tca8113作为靶细胞之一，以PRMI1640完全培养液传代培养。实验时将Tca8113细胞株细胞消化计数调整浓度为2×105/ml。将临床手术切除的人舌癌原发灶标本制成一定浓度的细胞悬液，同样以PRMI1640完全培养液培养。1.2化疗药物：As2O3哈尔滨医大附一院制备，储存液以生理盐水稀释为100mol/L。顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤(MTX)、氮芥(HN2)、平阳霉素(

9、BLEO)。2方法2.1将形态正常、生长良好的Tca8113细胞消化后，以2×105个细胞/ml的浓度接种于PRMI1640培养液内培养(37°C，5%CO2)。实验时收集细胞并用台盼蓝拒染法计数活细胞。细胞活力(%)=活细胞数/总细胞数×100%；生长抑制率(%)=(对照组-实验组)/对照组活细胞数×100%。2.2取对数增殖期细胞，0.25%胰酶消化单细胞悬液，将150200个Tca8113细胞接种于培养皿中，37°C、5% CO2饱和空气和湿度条件下培养24小时后加入药物，继续培养12天后终止培养，固定后姬姆萨染色，计数细胞集落，(细胞数

10、50个为一个集落)。克隆形成抑制率=(1-实验组克隆数/对照组克隆数)×100%。2.3将临床切除的新鲜舌癌标本组织块制成一定浓度的癌细胞悬液，采用MTT法检测As2O3-10mol/L、CDDP100g/ml、MTX、5-FU、NH2、BLEO的抗增殖作用。3结果3.1三氧化二砷对Tca8113的抗增殖抑制作用根据台盼蓝活细胞拒染法计数结果，得到三氧化二砷作用Tca8113细胞的不同时间、不同浓度的抗增殖抑制率，作出其量-效、时-效关系。(如1、2)在5mol/L浓度下作用Tca8113细胞72小时时，增殖抑制率达86.03%，作用120小时达95.15%。1三氧化二砷对Tca81

11、13细胞抗增殖作用的量效关系2三氧化二砷对Tca8113细胞抗增殖作用的时效关系3.2三氧化二砷对Tca8113细胞的克隆形成抑制试验结果克隆形成抑制试验也表明三氧化二砷对Tca8113细胞有明显的抗增殖抑制作用。在3mol/L浓度下其克隆形成抑制率76.63%，5mol/L浓度下克隆形成抑制率91.30%。(见3)3三氧化二砷对Tca8113细胞克隆形成抑制率的影响3.3三氧化二砷对临床舌癌细胞的药敏测定7例临床舌癌患者的临床标本分离细胞的药敏测定结果表明，三氧化二砷有较好的临床应用前景。三氧化二砷5例敏感，其1mol/L浓度下平均抑制率为39.5%;3mol/L浓度为47.2%;5mol/

12、L浓度下89%。PYM 5例敏感，平均抑制率为58.16%。MTX 6例敏感，平均抑制率为36.5%。5-Fu 6例敏感，平均抑制率为41.3%。3.4形态学变化倒置显微镜下见对照组细胞伸展性好，界限清楚，胞质均匀，核大，核仁清楚，细胞分裂相多见，生长良好，形成致密贴壁的多角形细胞。三氧化二砷低浓度组表面为细胞外形改变不明显，但细胞胞浆有发泡样表现。高浓度组孤立细胞多见，分裂相罕见，有较多细胞浮起。姬姆萨染色后观察，低浓度组可见细胞核浓缩、边聚，高浓度组细胞核膜不完整，细胞发泡更明显。4讨论三氧化二砷是人类最早用于治疗恶性肿瘤的化学药物之一，公元前16世纪即有砷剂治疗浅表皮肤癌的记录，19世纪

13、Lissauer应用亚砷酸溶液治疗慢性白细胞，这被认为是第一次使用抗癌药物治疗恶性肿瘤，本疗法直到20世纪30年代仍被报导用以治疗慢性髓细胞性白细胞1。本世纪50年代由于新的化疗药的不断发现，因砷剂的口服毒性极大其在肿瘤治疗领域渐被淘汰。三氧化二砷即砒霜，又是一种毒药。中毒剂量1050mg，致死剂量60mg2。口服微量的砷剂却有一定的有利的生物学效应，可扩张胃肠道的血管，促进微循环，改善分泌和吸收，也可升高白细胞；但在较大剂量下，可能引起毛细血管的极度扩张，刺激粘膜形成水泡，引起腹痛、腹泻、便血等中毒现象3。在砷剂的毒理学研究中还发现砷是肺癌和皮肤癌的诱导剂4。现代砷剂在恶性肿瘤治疗中的应用是

14、哈尔滨医科大学第一附属医院纯化砷剂注射液“癌灵一号”并且用于治疗急性早幼粒细胞白细胞取得显效开始5，上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所对其治疗机理的研究中发现三氧化二砷的治疗作用是诱导肿瘤细胞凋亡，且可能快速降解PML/RAR 融合基因蛋白或进行性下调bcl-2基因的mRNA和蛋白表达途径而诱导凋亡6。体外研究的报导表明，三氧化二砷对实体瘤食道癌、胃癌、直肠-结肠癌有相同的研究结果7，但临床一直未见有三氧化二砷在治疗实体瘤取得显效的报导。我们的体外研究从舌癌细胞系Tca8113细胞和临床舌癌标本分离肿瘤细胞都发现三氧化二砷对其有明显的抗增殖抑制作用。5mol/L浓度下作用Tca8113细胞72小时增殖抑制率达86.03%，作用120小时达95.15%，其克隆形成抑制率达91.30%；临床药敏测定亦表明三氧化二砷与临床常用化疗药PYM、MTX、5-Fu的药敏无明显差异，三氧化二砷应该有可能成为治疗口腔恶性肿瘤的有效化疗药物。三氧化二砷进入血液后，95%97%与红细胞内的血红蛋白结合，再分布至全身各组织器官8。倪建华等研