第一讲基因工程概述

1、LOGO马丽苹马丽苹Tel:OGOv基因工程（基因工程（gene engineering） 重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technique）：是）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为为“克隆克隆”）和）和 表达表达，这种有目的的应用分子克隆技术，这种有目的的应用分子克隆技术，人

2、为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为基因工程。基因工程。LOGO应用：应用：v 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。v 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产品。品。v 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等。制等。LOGO 分子生物学关键的技术突破：分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术重组技术1972年，年，世界上第一个重组世界上第一个重组DNA分

3、子诞生分子诞生Paul Berga biochemistry at Stanford猿猴病毒猿猴病毒DNA 噬菌体噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶 重组重组DNA分子分子1980年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖LOGO一、基因工程的酶学基础一、基因工程的酶学基础基因工程常用工具酶主要包括如下：基因工程常用工具酶主要包括如下：1、限制性内切酶、限制性内切酶3、连接酶、连接酶2、DNA聚合酶聚合酶4、其它修饰酶、其它修饰酶LOGO定义：指能识别定义：指能识别特定的特定的DNA序列序列并在一定并在一定的条件下可在识别位置或附近的条件下可在识别位置或附

4、近对对DNA 进进行切割行切割的酶。的酶。1、限制性内切酶限制性内切酶EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rLOGO限制性内切酶的种类限制性内切酶的种类 限制性活性限制性活性 + + +甲基化酶活性甲基化酶活性 + - +DNA识别序列识别序列 + + +切割特异性 随机随机 专一 切割位点距识别切割位点距识别 位点位点10-25bP对对ATP依赖性依赖性 +

5、- +对对Mg2+依赖性依赖性 + + +蛋白质结构蛋白质结构 3种不同亚基种不同亚基 单一成分单一成分 2种不同的亚基种不同的亚基 LOGO 型酶的特性：型酶的特性：（1）识别序列：4-8碱基的特异序列，通常具有回文结构回文结构： 如 EcoRI：GGCCA A T TT T A ALOGOB、平头末端(blunt end): 切割点位于识别位点的中间，切断的DNA片断具有平齐的末端（2）、切割方式：）、切割方式：A、粘性末端(sticky end): 两条DNA链上的切割点不一致，切断的DNA片断的末端上含有一条多个核苷酸的单链，包括包括5端凸出和端凸出和3端凸出。端凸出。产生两种切割方式

6、：产生两种切割方式：LOGO1 1）、产生）、产生 5端凸出粘性（如端凸出粘性（如EcoR I切点）切点）CTTAAGGAATTC 5-3 3-5 CTTAA G G AATTC 5-3 3-5 产生粘性末端LOGO2 2）、产生）、产生3粘性末粘性末末端：如末端：如PstI5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 LOGO 产生平末端：产生平末端：-TTT AAA-AAA TTT- TTT AAA - AAA TTT -CCCGGGGGGCCC55335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC33335533DraISmaILO

7、GO（3）同裂酶： 完全同裂酶：完全同裂酶： 识别位点和切点识别位点和切点完全相同完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。识别序列相同识别序列相同，切割位点有些相同相同，有些不同不同。LOGOXma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。 如如Xma I 和和 Sma I。 不完全同裂酶：不完全同裂酶：LOGO来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘能切出相同的粘性末端性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。如BamH I、Bgl、Xho等。（4）同尾酶）同尾酶(Isoca

8、udamers）LOGO(5).限制性核酸内切酶消化反应的进行限制性核酸内切酶消化反应的进行 A、限制性核酸内切酶的反应体系：、限制性核酸内切酶的反应体系： Tris-HCl 50 mM pH7.5 MgCl2 10 mM NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM Volume 20 - 100 l T，t 37 ，1 - 1.5 hr 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小小时，完全水解时，完全水解1 g 标准标准DNA所需的酶量所需的酶量LOGOB、限制酶消化反应的步骤、限制酶消化反应的步骤v 以下是对以下是对0.2-1.0 m

9、 mgDNA进行消化的典型反应步骤，如要对进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。进行消化，则反应的各个成分须相应放大。v a. 将将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为使总体积为18m ml。v b. 加入加入2m ml适当的适当的10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。匀之。v c. 加入加入1-2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。v d. 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行将上述混合的反应物置

10、于适当温度并按所需的时间进行温育。温育。v e. 加入加入05molL EDTA(pH80)使终浓度达使终浓度达10mmolL，以终止反应。以终止反应。LOGOC、限制性内切酶反应的终止、限制性内切酶反应的终止 消化消化DNA样品后，在进一步处理样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法：钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法：a.65温浴温浴5分钟。分钟。b.但有些酶，如但有些酶，如BamHI和和Hae对热稳定，则需加入终止对热稳定，则需加入终止反应液反应液(如加入如加入o5molL的的EDTA使之在溶液中的终浓使之在溶液中的

11、终浓度达到度达到10mmol/L)螯合螯合Mg2+，以终止反应。，以终止反应。c.此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。d.如果用限制性内切酶消化如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。后，直接上样进行凝胶电泳。LOGO（6）.影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素1 1）酶的纯度）酶的纯度2 2）DNADNA样品的纯度样品的纯度蛋白质、氯仿、苯酚、乙醇等均影响酶的活

12、性蛋白质、氯仿、苯酚、乙醇等均影响酶的活性3 3）DNADNA甲基化的程度甲基化的程度 甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性，甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性，在基因克隆中使用甲基化酶缺失的菌种制备质在基因克隆中使用甲基化酶缺失的菌种制备质粒粒DNADNA。4 4）酶切反应的温度和时间）酶切反应的温度和时间 大多数酶的最适反应温度为大多数酶的最适反应温度为3737，想缩短时，想缩短时间应加大酶量，若酶量较少可延长时间。间应加大酶量，若酶量较少可延长时间。LOGO5 5）DNADNA分子的构型分子的构型 超螺旋质粒超螺旋质粒DNADNA或病毒或病毒DNADNA酶解所需的酶量，比线性酶解所需的

13、酶量，比线性DNADNA酶解所需的酶量高得多，甚至可高达酶解所需的酶量高得多，甚至可高达2020倍。倍。6 6）反应缓冲液）反应缓冲液a.a.不同酶对离子强度要求不同，据此缓冲液分为不同酶对离子强度要求不同，据此缓冲液分为3 3种：种：0 - 50 mM 0 - 50 mM 低盐酶；低盐酶；100 mM 100 mM 中盐酶；中盐酶；150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶b.b.多酶的联合酶解多酶的联合酶解v 如果离子强度要求相同，可同时进行酶解，如果不如果离子强度要求相同，可同时进行酶解，如果不同，可采取以下措施：同，可采取以下措施：v 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；低盐酶先切，然后

14、补加盐，高盐酶再切；v 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；v 使用适合所有限制酶的通用缓冲液。使用适合所有限制酶的通用缓冲液。LOGO2、连接酶（、连接酶（Ligase)连接酶种类：连接酶种类：DNA连接酶连接酶和和RNA连接酶连接酶DNA连接酶：连接酶：1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接不但能连接粘性末端粘性末端， 还能连接还能连接齐平末端齐平末端。（1）、两种连接酶连接特点）、两种连接酶连接特点LOGO（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。（2）DNA 3

15、 端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+ +（2）. 连接条件连接条件LOGO 效率：粘性末端效率：粘性末端平端平端(100倍倍)； 5，突出突出3，突出；突出； 平端：平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI1）连接所用的目的连接所用的目的片段的状态片段的状态：（3）、影响连接效果的因素：）、影响连接效果的因素：LOGO ATP：反复冻熔，：反复冻熔，ATP活性降低，活性降低，ATP溶解度不高，溶解度不高，连接缓冲液宜分装；连接缓冲液宜分装； 单价离

16、子：单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果；，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率以下可以提高连接效率 DTT（二硫苏糖醇，保护酶）（二硫苏糖醇，保护酶） Mg2+连接效果最好在37 ，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定;2）连接）连接温度：温度：3）反应液中的成分：反应液中的成分：LOGO目的或作用：目的或作用：4）插入片段与载体的浓度比例）插入片段与载体的浓度比例 载体载体DNA与外源与外源DNA的分子摩尔比通的分子摩尔比通常为常为13左右，甚至左右，甚至110 或更高或更高。增加插入片段与载体的接触机会，减

17、增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。少载体自我连接的现象。LOGODNA连接酶的反应条件：连接酶的反应条件： Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 Mm DTT 5 mM Volume 10 - 20 l T, t 4 - 15 , 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应反应1 小时，小时，完全连接完全连接1 g -DNA（Hind III片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。 LOGO 依赖依赖DNA的聚合酶：的聚合酶： DNA聚合酶聚合酶

18、I 依赖依赖RNA的的DNA聚合酶：聚合酶：逆转录酶 不依赖不依赖DNA的聚合酶：末端转移酶的聚合酶：末端转移酶2、DNA聚合酶聚合酶（Polymerase）（1）DNA聚合酶类型：LOGO（2）基因工程中常用的）基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1）、大肠杆菌）、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2）、）、Klenow fragment 3）、）、 T7 DNA聚合酶聚合酶 4）、）、 T4 DNA聚合酶聚合酶 5）、逆转录酶）、逆转录酶6）、）、Taq DNA聚合酶聚合酶7）、高保真）、高保真DNA聚合酶聚合酶8）、测序）、测序DNA聚合酶聚合酶LOGO 基本性质： 5 533的的DNADNA聚

19、合酶活性；聚合酶活性； 5 533的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性； 3 355的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。1）、大肠杆菌）、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（ DNA pol I ）LOGO KlenowKlenow酶的来源：酶的来源： 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N N端三端三分之二的大肽段，即为分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶。酶。 Klenow酶的基本性质： 53的DNA聚合酶活性 35的核酸外切酶活性2)、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 大片段（大片段（ Klenow ）LOGOLOGO

20、3）、）、T4、T7-DNA聚合酶聚合酶基本特性： 均具有53的DNA聚合酶活性， 35的核酸外切酶活性 T4聚合酶35的核酸外切酶活性强，而T7聚合酶53的DNA聚合酶活性强。LOGO依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶,最主要用途，以最主要用途，以mRNA为模板合成为模板合成cDNA3AAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTTT5mRNA3cDNA3AAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTT5mRNAoligo(dT)12-18反转录酶反转录酶Mg2+ dNTP4)、反转录酶、反转录酶LOGO5)、Taq DNA聚合酶聚合酶 特点：特点： 分离自水生栖热菌，分子量为分离自

21、水生栖热菌，分子量为94,000，最，最适反应温度适反应温度75， 对对95高温具良好稳定性，高温具良好稳定性，该酶不存在该酶不存在35外切酶活性。外切酶活性。 用途：用途： 主要用于主要用于DNA的体外扩增的体外扩增（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）LOGO6）高保真）高保真DNA聚合酶聚合酶v pfu DNA 聚合酶聚合酶:是从是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高中精制而成的高保真耐高温保真耐高温DNA聚合酶，它不具有聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具外切酶活性，但具有有3-5外切酶活性，可校正外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，扩增过程中产生的错误，使

22、产物的碱基错配率极低。使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无产物为平端，无3端突出端突出的单的单A核苷酸。核苷酸。v Vent DNA 聚合酶聚合酶:该酶是从该酶是从Litoralis栖热球菌中分离出的，栖热球菌中分离出的，不具有不具有5-3外切酶活性，但具有外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可以去外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能。除错配的碱基，具有校对功能。 LOGO6）测序）测序DNA聚合酶聚合酶v 测序级测序级TaqDNA聚合酶聚合酶 ：是在：是在TaqDNA聚合酶的基础上对聚合酶的基础上对它进行修饰，去除它进行修饰，去除5-3外切酶活性，保证测序记过的高度外切酶活性

23、，保证测序记过的高度准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。v Bca Best DNA 聚合酶聚合酶 ：从：从Bacillus Caldotenax YT-G菌株菌株中提纯，并使其中提纯，并使其5-3外切酶活性缺失的外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的聚合酶。它的伸长性能优越；可抑制伸长性能优越；可抑制DNA二级结构形成，可以得到均一二级结构形成，可以得到均一的的DNA测序带。测序带。 LOGO4、其它修饰酶、其它修饰酶碱性磷酸酶：功能为去除DNA或RNA5末端的磷酸反应，包括： 来自小牛胸腺的碱性磷酸酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BA

24、P）磷酸激酶： 在DNA、RNA的5-OH上加磷酸，常用于探针标记其它酶：核酸外切酶III、 VII、 S1核酸酶、RNaseA、 DNaseLOGO二、基因工程的载体系统二、基因工程的载体系统载体（载体（vectorvector）：携带外源）：携带外源DNADNA，实现外源，实现外源DNADNA在受体细胞中在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。 LOGO载体的功能：载体的功能：v运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；v为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；v为

25、外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。LOGO1.按功能按功能克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体（表达载体（expression vector） 2.按基本元件按基本元件的来源的来源分类：分类：质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等LOGO 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；移性）； 具有合适的具有合适的筛选标记筛选标记； 具有较高的外源具有较高的外源DNADNA的载装能力；的载装能力； 具有多克隆位点具有多克隆位点（MCS

26、）； 具有与特定受体细胞相适应的具有与特定受体细胞相适应的复制位点复制位点或整或整合位点。合位点。载体应具备的条件载体应具备的条件：LOGO 基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)：原核生物：原核生物： 质粒、质粒、噬菌体、考斯质粒噬菌体、考斯质粒（cosmid）、单链）、单链DNA噬菌体噬菌体M13真核生物：真核生物： 酵母菌质粒、人造染色体载体，酵母菌质粒、人造染色体载体，植物植物Ti质粒，动物病毒。质粒，动物病毒。LOGO一）、质粒一）、质粒1 1、质粒的基本特征：、质粒的基本特征：（1）质粒的自主复制性质）质粒的自主复制性质质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DN

27、A复制系统进行自主复制。复制系统进行自主复制。 严紧型：严紧型：1 - 3 拷贝，拷贝，复制受宿主影响大。复制受宿主影响大。 松弛型：松弛型：10 - 60 拷贝，拷贝，复制受宿主影响小。复制受宿主影响小。因此，通常选用松弛型质粒作为基因工程的载体，以获得高拷贝数，但拷贝数太大，易对宿主细胞造成毒性。 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的体之外的双链环状双链环状DNA，具有，具有独立复制独立复制的能力，通的能力，通常带有细菌的常带有细菌的抗药基因。抗药基因。LOGO（2）质粒的不相容性）质粒的不相容性 任何两种含有任何两种含有相似复制子结构相

28、似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。质粒不相容质粒不相容性保证了基因工程的安全性。性保证了基因工程的安全性。（3）质粒的可转移性，）质粒的可转移性，如如F、Col、R质粒等质粒等（4）携带特殊的遗传标记：）携带特殊的遗传标记： 物质抗性：如抗生素、重金属离子物质抗性：如抗生素、重金属离子 物质合成：如细菌毒素、有机碱物质合成：如细菌毒素、有机碱v 这些这些标记基因对标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。LOGO抗生素基因：抗生素基因：bla or amp

29、r: 抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素cat or amlr: 抗绿霉素抗绿霉素kan or kanr: 抗卡那霉素抗卡那霉素str or strr: 抗链霉素抗链霉素tet or tetr: 抗四环素抗四环素LOGOLOGO2、常用的质粒载体、常用的质粒载体类型类型1）、克隆质粒载体）、克隆质粒载体 克隆质粒载体克隆质粒载体是指专用于基因或是指专用于基因或DNA片段无性繁殖片段无性繁殖的质粒载体。如：的质粒载体。如：pBR322及其派生质及其派生质粒载体、粒载体、pUC系列系列载体、载体、T载体。载体。 LOGOT载体载体LOGO1）定义：）定义：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋专用于在宿主细胞中

30、高水平表达外源蛋白质的质粒载体。白质的质粒载体。2）特点：特点：具有转录起始子，如具有转录起始子，如Lac、Trp、Tac、PL、PR核糖体结合位点核糖体结合位点具有转录终止子，位于外源基因的下游具有转录终止子，位于外源基因的下游分泌型表达载体还具有信号肽编码序列，位于启分泌型表达载体还具有信号肽编码序列，位于启动子之后，外源基因之前。动子之后，外源基因之前。2）.表达质粒载体表达质粒载体LOGO表达载体表达载体(根据受体细胞根据受体细胞)原核细胞表达载体原核细胞表达载体真核细胞表达载体真核细胞表达载体表达载体表达载体(根据表达蛋白的转运根据表达蛋白的转运)分泌型表达载体分泌型表达载体非分泌型

31、表达载体非分泌型表达载体表达载体表达载体(根据表达蛋白的组成根据表达蛋白的组成)融合型表达载体融合型表达载体非融合型表达载体非融合型表达载体3）分类：）分类：LOGOpBV221rrnB 大肠杆菌表达载体的特征大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比与克隆载体相比)：强启动强启动子；如子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子启动子。SD序列；序列；强终止子。如强终止子。如rrnB。LOGO简化外源蛋白纯化的载体简化外源蛋白纯化的载体(标签载体标签载体) pBAD/His常用的标签常用的标签：多聚组氨酸残基多聚组氨酸残基、结合麦芽糖蛋白结合麦芽糖蛋白、谷胱甘肽谷胱甘肽-s-转移转移酶酶

32、。 亲和层析法纯亲和层析法纯化外源蛋白化外源蛋白。LOGO融合蛋白融合蛋白Ni-affinity chromatography6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonic bond His-tag Protein可以加入蛋可以加入蛋白酶切位点白酶切位点His taqHis taqTAANcoI (ATG)EcoRIHindIII离子键离子键亲和层析亲和层析LOGO3）、多功能质粒载体）、多功能质粒载体 具有具有克隆克隆、表达表达、测序测序、体外转录体外转录等多种功能，避免了等多种功能，避免了重复操作。如重复操作。如pGEM系列质粒载体：系列质粒载体： LOGO4）

33、、穿梭质粒载体）、穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector) 穿梭质粒载体穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。的质粒载体。 如：如：大肠杆菌大肠杆菌-土壤农杆菌土壤农杆菌穿梭质粒载体穿梭质粒载体(植物转化载植物转化载体体)、大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母酿酒酵母穿梭质粒载体穿梭质粒载体(见下图见下图)、大肠杆菌大肠杆菌-枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌大肠杆菌-动动物细胞

34、物细胞穿梭质粒载体穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌，但还没有大肠杆菌-植物植物细胞穿梭质粒载体。细胞穿梭质粒载体。 LOGOLOGO二）、噬菌体载体（bacterium phage）1、噬菌体载体噬菌体载体 属温和型噬菌体；属温和型噬菌体； 具有具有COS黏性末端；黏性末端； 类型分为：替换型和插入型；类型分为：替换型和插入型； 替换型载体替换型载体-可插入可插入12-25KB的片的片 插入型载体插入型载体-可克隆小于可克隆小于10KB的片段的片段 溶原状态与溶菌状态溶原状态与溶菌状态:DNA重组技术一重组技术一般需要般需要噬菌体进入噬菌体进入溶菌溶菌状态状态 筛选标记：筛选

35、标记： imm434和和lacZ等等 装载装载25KB，克隆载体。，克隆载体。LOGOBamHILOGO2、柯斯质粒、柯斯质粒 (Cosmid ）v 是一种是一种带有黏性末端位点带有黏性末端位点的的质粒质粒v 构建：构建：是一种以是一种以 噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的具有噬菌体的COS位点和质位点和质粒的复制子粒的复制子，具有噬菌体和质粒的双重特征。，具有噬菌体和质粒的双重特征。LOGO黏粒克隆的基本程序黏粒克隆的基本程序LOGO柯斯质粒载体的特征：具有噬菌体的特点:具有COS位点-体外包装成噬

36、菌体颗粒环化，不形成噬菌斑。具有质粒载体的特点:在寄主内复制和具抗生素抗性基因。克隆能力强：克隆能力强：31-45KB黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建基因组文库构建：由于其克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳性克隆的检出率，大大地减少了工作量。LOGO三）、人工染色体载体类型类型vYAC： yeast artificial chromosome，酵母人工染，酵母人工染色体色体vBAC： bacterial artificial chromosomes ，细菌人，细菌人工染色体工染色体vMAC：哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体LOGO1、酵母人工染色体、酵母人工染色体

37、(YAC) 酵母自主复制序列酵母自主复制序列；酵母着丝粒酵母着丝粒；四膜虫端粒四膜虫端粒；酵母选择性标记酵母选择性标记(Trp1、Ura3)。克隆容量克隆容量：1002000kb SUP411.4 kbLOGO2、细菌人工染色体、细菌人工染色体 (BAC)6.9 kb来源于来源于F质粒。质粒。克隆容量克隆容量：300kb优点优点：拷贝数低，稳定，比拷贝数低，稳定，比YAC易分离易分离。 LOGO3、哺乳动物人工染色体、哺乳动物人工染色体(MAC) 结构组成结构组成：哺乳动物细胞染色体的复制起始区、端粒、哺乳动物细胞染色体的复制起始区、端粒、着丝粒。着丝粒。 克隆容量克隆容量：1000kb以上以

38、上 用途用途：研究保证有丝分裂、减数分裂精确进行所需要研究保证有丝分裂、减数分裂精确进行所需要的的DNA片段大小；片段大小； 研究哺乳类细胞中染色体的功能；研究哺乳类细胞中染色体的功能； 利用利用 MAC的巨大包容性对大而复杂的基因进行克隆的巨大包容性对大而复杂的基因进行克隆和功能分析；和功能分析； 用于用于基因治疗基因治疗。 LOGO载体载体插入插入DNADNA片段片段宿主细胞宿主细胞质粒质粒510 kb细菌，酵母细菌，酵母噬菌体载体噬菌体载体 25 kb细菌细菌黏粒黏粒50 kb细菌细菌BACBAC400 kb细菌细菌YACYAC3Mb酵母酵母LOGO四）、植物基因工程载体四）、植物基因工

39、程载体1、 质粒转化载体质粒转化载体v Ti质粒质粒(tumor-inducing plasmid)v Ri质粒质粒(root-inducing plasmid)2、病毒转化载体、病毒转化载体v 双链双链DNA病毒转化载体病毒转化载体 花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)： 克隆克隆250bp左右左右v 单链单链DNA病毒转化载体病毒转化载体双粒病毒双粒病毒Begomoviruses：两个单链环状：两个单链环状DNA分子，感染分子，感染双子叶植物，粉虱传播，如双子叶植物，粉虱传播，如番茄金花叶病毒番茄金花叶病毒(TGMV) Mastreviruses：1个单链环状个单链环状DNA分子，感染

40、单分子，感染单子叶植物，叶蝉传播，如子叶植物，叶蝉传播，如小麦矮化病毒小麦矮化病毒(WDV) LOGO、RNA病毒转化载体病毒转化载体 基本操作方法基本操作方法： a、病毒、病毒 RNA反转录成单链反转录成单链cDNA； b、单链、单链cDNA合成双链合成双链cDNA； c、将双链、将双链cDNA克隆到质粒、克隆到质粒、Cosmid中；中； d、然后将外源基因插入到克隆在质粒的病毒、然后将外源基因插入到克隆在质粒的病毒cDNA中；中； e、通过体外转录获得病毒、通过体外转录获得病毒-外源基因的外源基因的嵌合嵌合RNA去感染去感染植物。植物。 烟草花叶病毒烟草花叶病毒 、马铃薯、马铃薯X病毒已通

41、过外源基因插入到运病毒已通过外源基因插入到运动蛋白基因与外壳蛋白基因之间或取代外壳蛋白基因在植动蛋白基因与外壳蛋白基因之间或取代外壳蛋白基因在植物中表达。物中表达。LOGO五）、动物基因工程载体五）、动物基因工程载体 动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体。动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体。 动物病毒侵入动物细胞后，呈现类似于噬菌体的两类生动物病毒侵入动物细胞后，呈现类似于噬菌体的两类生长状态，即裂解感染和整合性感染。长状态，即裂解感染和整合性感染。 1、SV40病毒载体：猿猴空泡病毒。病毒载体：猿猴空泡病毒。 2、反转录病毒载体、反转录病毒载体 3、杆状病毒载体：受体为

42、昆虫细胞、杆状病毒载体：受体为昆虫细胞 4、痘苗病毒载体：基因工程疫苗制备载体、痘苗病毒载体：基因工程疫苗制备载体 5、腺病毒载体、腺病毒载体 ：基因治疗载体：基因治疗载体 LOGO 三）、目的三）、目的DNA与载体连与载体连接接（接）；（接）；四）、重组四）、重组DNA转转入受体细胞（转）；入受体细胞（转）；五）、重组体的五）、重组体的筛筛选与鉴定（筛）。选与鉴定（筛）。三、三、DNA克隆的过程包括五个基本部分：克隆的过程包括五个基本部分：一）、目的一）、目的DNA的的分分离获取（分）；离获取（分）；二）、载体的选二）、载体的选择择与准备（择）；与准备（择）；LOGO一）、目的一）、目的DN

43、A的的分分离获取（分）；离获取（分）；v 基因组文库（非编码序列）基因组文库（非编码序列）v cDNA文库文库v PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆构建或从商品化的有其它克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增）文库扩增）v 人工合成基因片段（价钱昂贵）人工合成基因片段（价钱昂贵）二）、载体的选二）、载体的选择择与准备（择）；与准备（择）；LOGO 三）、目的三）、目的DNA与载体连接（接）与载体连接（接）T4DNA ligaseLOGO Ligation EcoRIEcoRIRE digestion VectorEcoRIV

44、ectorRE digestion RecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI 单酶消化的粘性末端连接：单酶消化的粘性末端连接：连接效率高连接效率高; ; 载体需去磷酸载体需去磷酸; ;双向连入载体双向连入载体LOGO 平头末端连接：平头末端连接：LOGOTarget geneEcoRIBamHIEcoRIBamHIVectorVectordigestiondigestionLigation VectorEcoRIBamHI 双酶消化的粘性末端连接：双酶消化的粘性末端连接：连接效率高连

45、接效率高; ;定向连接定向连接. . LOGO Vector EcoRVEcoRV digestionVector Taq DNA polymerasedTTPT-Vector 55 TT55AAPCR productRecombinantvector AATTPCR productLigation T-A T-A粘性末端连接：粘性末端连接：连接效率高连接效率高双向双向连入载体连入载体 自身环化率自身环化率LOGO 四）、重组四）、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）转入宿主细胞进行扩增（转）感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：）：处于易于接纳外源物质的状态的细菌处于易于接

46、纳外源物质的状态的细菌LOGO（一）转化方法（一）转化方法v常用的重组子转化方法常用的重组子转化方法原核受体细胞：转化、转导、转染、电穿孔原核受体细胞：转化、转导、转染、电穿孔真核受体细胞：磷酸钙共沉淀、电穿孔、真核受体细胞：磷酸钙共沉淀、电穿孔、基因枪基因枪、显微注射显微注射、脂质体介导法、血影细胞介导法、脂质体介导法、血影细胞介导法、农农杆菌介导法杆菌介导法、DEAE-葡聚糖转染、反转录病毒感葡聚糖转染、反转录病毒感染、原生质体融合法染、原生质体融合法LOGO1. Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 （1）基本原理：）基本原理： 转化的定义：以质粒为载体的重组转化的定

47、义：以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程分子引入受体细胞的过程 适用于适用于G- -细菌（如大肠杆菌等），细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理年建立此技术，其原理是是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，细胞膜出现空隙，使质粒载体转移进受体细胞收缩作用，细胞膜出现空隙，使质粒载体转移进受体细胞 （2）操作过程：）操作过程： 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备：感受态细胞，感受态细胞， CaCl2处理处理 重组体向受体细胞的导入：热刺激重组体向受体细胞的导入：热刺激 后培养后培养LOGOL

48、OGO2. 噬菌体介导的转染与转导噬菌体介导的转染与转导 （1）原理：）原理： 转染转染：以噬菌体为载体构建的重组：以噬菌体为载体构建的重组DNA分子直接感染进分子直接感染进入受体细胞入受体细胞. 转导转导：重组的噬菌体：重组的噬菌体DNA或粘粒或粘粒DNA经包装成完整的噬经包装成完整的噬菌体颗粒后，通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组菌体颗粒后，通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA转移至受体细胞。转移至受体细胞。 （2）操作过程：）操作过程： 感受态细胞的培养：感受态细胞的培养： 吸附：吸附： 转染裂解：转染裂解：LOGO3.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀（1）基本原理）基本原理 将转移的将

49、转移的DNA溶液与适量溶液与适量CaCl2的溶液混合，再加入的溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成一定量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA磷酸钙沉淀复合磷酸钙沉淀复合物。将适量的该复合物加入细胞培养液中，通过细胞的物。将适量的该复合物加入细胞培养液中，通过细胞的胞胞饮作用饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐降解。色体上，或游离于细胞质中逐渐降解。（2）操作步骤：）操作步骤： DNA磷酸钙沉淀复合物的制备磷酸钙沉淀复合物的制备 沉淀复合物向受体细胞的转移沉淀复合物向受体细胞的转移 后培养后培养LOGOLOGO

50、4.电穿孔转化（电击转化法）电穿孔转化（电击转化法）（1）基本原理：）基本原理： 在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生临时性在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生临时性缝隙或微孔，质粒或缝隙或微孔，质粒或DNA重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。基因的转移。（2）操作过程：）操作过程： 将待转化的质粒或将待转化的质粒或DNA重组子与受体细胞混合后，加在电穿孔重组子与受体细胞混合后，加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场数分钟，最后将处理过的细胞转化仪的样品池中，两极施加高压电场数分钟，最后将处理过的细胞转移到新鲜培

51、养基中后培养一段时间。转移到新鲜培养基中后培养一段时间。 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。细胞均有效，但转化效率差别很大。LOGO利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片电穿孔仪电穿孔仪LOGO5. 基因枪基因枪（1）基本原理：）基本原理： 利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源有外源DNA的金粉（或钨粉）等金属微粒加速，射入受体的金粉（或钨粉）等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源细胞或组织，从而达

52、到将外源DNA分子导入细胞的目的。分子导入细胞的目的。（2）操作过程：）操作过程： 受体细胞或组织的预处理受体细胞或组织的预处理 DNA微弹的制备微弹的制备 受体材料的轰击受体材料的轰击 过渡培养与筛选培养过渡培养与筛选培养LOGO各种类型的基因枪各种类型的基因枪LOGO6. 显微注射显微注射（1）基本原理：）基本原理： 借助显微操作仪将外源基因直接注入受体细胞，并使其成活、增借助显微操作仪将外源基因直接注入受体细胞，并使其成活、增殖而发育成转基因个体。殖而发育成转基因个体。（2）操作过程：）操作过程： 受体细胞的制备：多为受精卵受体细胞的制备：多为受精卵 外源基因的注入显微注射外源基因的注入

53、显微注射 受体细胞的培养受体细胞的培养LOGOLOGO显微注射获得转基因超级鼠示意图显微注射获得转基因超级鼠示意图 LOGO7.其他导入方法其他导入方法 脂质体介导法：脂质体介导法：通过脂质体与DNA静电结合或直接将DNA包裹，并透过细胞膜把DNA运送到细胞内，实现外源基因的有效转染。 血影细胞介导法：血影细胞介导法：通过红细胞的溶血形成具有强通透性的血影细胞，将外源DNA转入血影细胞，再让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而将外源DNA导入受体细胞 原生质体融合法：原生质体融合法：用酶去除微生物和植物细胞的细胞壁，形成原生质体，将外源基因与原生质体混合，在PEG（聚乙二醇）作用下

54、使外源基因导入细胞。LOGO（二）转化细胞的扩增（二）转化细胞的扩增1. 扩增操作： 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作 原生质体转化后的再生过程2.扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定LOGO筛选出含有筛选出含有(目的基因目的基因+载体载体

55、)的克隆的克隆 转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：LOGO 五）、重组体的筛选与鉴定（筛）五）、重组体的筛选与鉴定（筛）遗传学检测法遗传学检测法核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法物理检测法物理检测法外源基因产物检测外源基因产物检测核酸序列分析及其他方法核酸序列分析及其他方法LOGO一、遗传学检测法一、遗传学检测法（一）抗药性筛选法（一）抗药性筛选法1.1.抗药性筛选法的基本原抗药性筛选法的基本原理理 抗药性筛选法可区分转化子抗药性筛选法可区分转化子 与非转化子、重组子与非重与非转化子、重组子与非重组子组子 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点，则位点，则 非重组

56、子呈非重组子呈AmpAmpr r、TetTetr r 重组子呈重组子呈AmpAmpr r、TetTetr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点，则位点，则 非重组子呈非重组子呈AmpAmpr r、TetTetr r 重组子呈重组子呈AmpAmpr r、TetTets s供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断 转基因动物(畜牧业、渔业 生物反应器)转基因植物(农业、林业 生物反应器)冶金、环保轻工、食品LOGO2.抗药性筛选法的基本操作抗药性筛选法的基本操作v 先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有Amp的平的平板板v

57、再将再将Amp平板上的转化子影印平板上的转化子影印至含有至含有Amp和和Tet的平板上的平板上v 在在Amp平板上生长、但在平板上生长、但在Amp和和Tet 平板上不长的转化平板上不长的转化子即为目的重组子子即为目的重组子LOGO（二（二）显色筛选法）显色筛选法1. 显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易

58、于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的携带的lacZ基因（蓝基因（蓝色反应）、链霉菌质粒色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的携带的melC基因（黑色基因（黑色反应）等。反应）等。LOGO2.显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作：将外源基因克隆在将外源基因克隆在pUC18 的的lacZ标记基因内部，使之灭活，标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈此时重组子呈Apr、lacZ-，白色，白色菌落；而非重组子则呈菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落，蓝色菌落将转化后的受体细胞涂布在含将转化后的受体细胞涂布在含有有X-gal和乳糖诱导物和乳糖诱导物IPTG的培的培养基中，培养一段时间后观察养基中，培养一段时间后观察菌落颜色菌落颜色LOGOIPTGLOGOLOGOLOGO（三）营养