质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)

1、质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29来源：易生物实验 浏览次数：6084网友评论0条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1 质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不 同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和9复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。图 3-1是其复制其始示意图。在复制时，首先合成前RNA II，即前引物，并与DNA

2、形成杂交体；而后 RNase H切割前RNA I，使之成为成熟的RNA I，并形成三叶草二级结构， 该引物引导质粒的复制。形成的 RNA I可控制RNA I形成二级结构，同时 Rop增强RNA I的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNA I和RNA I 之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1或（ColE1 ）复制子的拷贝数。nriRNAI图3-1带pMB1 （或ColE1 ） 复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。2质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表5-1就是不同类的质粒与复制子及拷

3、贝数的大致关系表3-1:质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数PBR322及其衍生质粒pMB11520pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500700pACYC及其衍生质粒p15A10 212pSC101及其衍生质粒pSC1015ColE1ColE11520pUC系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。pMB1质粒 的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I , DNA聚合酶 川），依赖于DNA 的RNA 聚合酶，以及 宿主基因dnaB、dnaC 、dnaD和danZ的产物。因此，存在抑制蛋白质 合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观

4、霉素等 抗生素时，带有pMB1 （或 ColEI ）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚23千个质粒。3 质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个 质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利 用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个 细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争， 随机挑选，微小的差异最终被 放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群，如 ColE1 和pMB1 ，pS

5、C101 和p15A。4 .转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作 用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因tra ，顺式因子bom及 其内部的转移缺口位点nic。二、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记用于鉴 别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来，筛选标记 可用于将特殊表型的重组子挑选出来。（一） 选择标记抗生素 抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1氨苄青霉素抗性基因（ Ampicillin resistance gene, ampr） 氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记

6、，绝大多数在大肠 杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成， 与有关 的酶结合并抑制其活性， 抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶， 该酶 可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化禺内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 青霉素是一类化合物的总称， 其分子结构由侧链 R-CO- 和 主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在6-APA 中有一个饱和的噻唑 环（A）和一个 伕内酰胺环，6-APA为由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽。 2四环素抗性基因（ Tetracycline resistance gene, tetr）四环素可与核糖体 30S 亚基

7、的一种蛋白质结合， 从而抑制核糖体的转位。 四 环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入 细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外， 还带有四环素抗性基因。 3氯霉素抗性基因（ chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。 目前使用的氯霉素抗性 基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9 ）。 cat 基因编码氯霉素乙酰 转移 酶，一个四聚体 细胞质蛋白（每个亚基 23kDa ）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下， 该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生

8、物，使之不能与核糖体结合。 4卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋 白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸 转移酶 （APH （3'） -H , 25kDa ）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸 化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。 在细胞中合成的这种酶可以分泌至外 周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。5琥珀突变抑制基因 supF在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的

9、突变为赭石突变 （突变为 UAA ），或琥珀突变 （突变为 UAG ），或乳白突变（突 变为 UGA ）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译 酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿 主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。相应的， supE 基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。由于目前所用的标记基因使用方便，因此用这类 标记的载体较少。6其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外 源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽 胞杆菌

10、 （Bacillus amyloliquefaciens ） ，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养 基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的， 因此该基因可用于插入失活筛 选重组子。（二）筛选标记筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入 到一个质粒载体上时， 可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒， 即重组质粒。1 . a-互补（acomplementation ）a-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵 基因区段的 俟半乳糖苷酶（B-galactosidase ，由1024个氨基酸组成）阴性 的突变体之间实现互补。a-互补是基

11、于在两个不同的缺陷伕半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码 伕半乳糖苷酶，如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的 B半乳糖苷酶。例如， lacZ M15基因是缺失了编码B半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。 对于只编码 N- 端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ'） ， 其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复B-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。在 lacZ' 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位 点），不影响 俟半乳糖苷酶的功

12、能内互补。但是，若在该 DNA小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无a互补能力的 禺半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZ M15放在F质粒上,随宿主传代；lacZ'放在载体上，作为 筛选标记 （图3-2）。相应的受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue ，前 二者均带有 D （lac - proAB）F' proAB + lacIq lacZD M15基因型。其中 lacI 为lac阻抑物的编码基因，laclq突变使阻抑物产量增加，防止lacZ基因渗漏 表达。lacZ基因是乳糖lac操纵子中编码

13、 &半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可 诱导其表达。乳糖既是lac操纵子的诱导物，也是作用的底物。异丙基-伕D-硫 代半乳糖苷（IPTG ）是乳糖的衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能作 为反应的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-俟D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal还可充作生色剂，被伕半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色LacZ-團二13和如玄多肚泊结构关系庄刑通过伍互补产生的苗蒂莎色变化（右）2 插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（a

14、mpr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入 tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过 对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。三、质粒载体的种类（一）克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存 DNA片段，是最简单的载体。1. pBR322图 M 3m pER322 JSfeBlSpBR322 质粒的大小为4361bp, GenBank 注册号为 V01119 和J01749,含有30多个单一位点，具有四环素抗性基因(tetr )和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，其质粒复制区来自pMB1 (如图3-3 )。目前使用广泛的多质粒载体 几乎都是由此发展而

15、来的。利用四环素抗性基因内部的BamH I位点来插入外 源DNA片段，可通过插入失活进行筛选。2. pUC18 和 pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成 紧凑，几乎不含多余的 DNA片段，GenBank注册号为L08752 ( pUC18 )和 X02514 ( pUC19 )。由 pBR322 改造 而来，其中 lacZ ( MSC ) 来自 M13mp18/19 图3-4 是其质粒图谱。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700。 pUC系列载体含有一段l

16、acZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现a-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过a-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。puciaGA.ATTGGAGCTCGGTACCCGGGATGCTCTAGAGTCGAGCTGCA£iGCATGCTTGGCF>UCigGCCAAGCTTGCATQCCrGCAGGTCQACTCTAGAQQATCCCCGGGTACCQAGCTCGAATTCHirld IIIJ11 J11Xhl 1ElainH |Kpn IXmalEcoOlDBI (2&74Him II4480Vs«pi (25O1JS

17、m J (217?)*SDt hg< unitwPUC18/192&MbpktU II (1O5O：.uAtaN 1(1217)CttlOl (1779)图3-4 : pUC18/19 质粒图谱3. pUC118 和 pUC 119由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为 3162bp, GenBank注册号为 U07649 (pUC118 )和 U07650 (pUC119 )。相当于在 pUC18/19 中 增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列4. pGEM-3Z/4ZPGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一

18、些功能片段改造而来，大小为 2.74kb, Gen Ba nk 注册号为 X65304 ( pGEM-3 Z, 2743bp )和 X65305 ( pGEM-4 Z, 2746)。与pUC18/19 相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子， 如Sp6和T7噬菌体的启动子。pGEM-3Z 和pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置5.多功能质粒载体在上述载体的基础上，人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体综合了以上质粒的特点。除了作为质粒载体基本要素外，综合了上述功能要素，如多克隆位点、a互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有pBluescript n KS ( ± ,这类质粒一般由4个质粒组成一套系统， 其差别在于多克隆位点方向相反(根据多克隆位点两端Kpn I和Sac I的顺序，用KS或SK表示)，或单链噬菌体的复制启始方向相反(或者说，引导DNA