课题1微生物的实验室培养和分离(上新课)2016

1、酵母菌酵母菌18-25有氧：有氧呼吸，大量繁殖有氧：有氧呼吸，大量繁殖无氧：无氧呼吸，产生酒精无氧：无氧呼吸，产生酒精醋酸菌醋酸菌30-35 有氧：糖源充足，将糖分解成醋酸有氧：糖源充足，将糖分解成醋酸缺少糖原，将乙醇变为乙醛再变为醋酸缺少糖原，将乙醇变为乙醛再变为醋酸毛霉等毛霉等15-18蛋白酶将蛋白质分解成肽、氨基酸蛋白酶将蛋白质分解成肽、氨基酸脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸乳酸菌乳酸菌无氧：无氧呼吸，产生乳酸无氧：无氧呼吸，产生乳酸30-40微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：真菌真菌原生动物原生动物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病

2、毒界病毒界单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：菌落菌落(P18)(P18)鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖肉眼可见的肉眼可见的子细胞群体子细胞群体根霉根霉 曲霉曲霉 青霉青霉课题1 微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染一、培养基一、培养基1 1、概念：、概念： 人们按照微生物对营养物质的不同人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质需求，配置出供其生长繁殖的营养基质。按物理性质划分按物理性质划分

3、固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基表面生长表面生长固体培养基：菌落固体培养基：菌落沉淀生长沉淀生长均匀混浊生长均匀混浊生长半固体培养基半固体培养基：2 2、分类：、分类：按用途划分按用途划分基础培养基：基础培养基：鉴别培养基鉴别培养基: :含有一般微生物生长繁殖所需的基本营含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。在培养基中群体中分离出来的培养基。在培养基中加加入特殊营养物质或化学物质入特殊营养物质或化学物

4、质，有利于特定有利于特定微生物的生长，同时抑制其它微生物的生微生物的生长，同时抑制其它微生物的生长长。如。如 的培养基的培养基。选择培养基选择培养基: :用于鉴别不同类型微生物的培养基。微用于鉴别不同类型微生物的培养基。微生物产生某种代谢产物，与培养基中的生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特殊化学物质发生特定的化学反应特定的化学反应，产，产生明显的特征变化。如？生明显的特征变化。如？以尿素为唯一氮源、以尿素为唯一氮源、以纤维素为唯一碳源以纤维素为唯一碳源在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，以纤维素为唯一碳源的培养基中加入以纤维素

5、为唯一碳源的培养基中加入刚果红。刚果红。选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基: : 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基: : 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基: : 分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基: : 分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基: : 分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞【例例】以下是单克隆抗体制备流程示意图：以下是单克隆抗体制备流程示意图： 根据培养基的根

6、据培养基的_分类，图中分类，图中HATHAT培养基培养基属于属于_培养基培养基选择选择用途用途一、培养基一、培养基 一般都含有一般都含有 四类四类物质，此外还要满足微生物生长对物质，此外还要满足微生物生长对 、 以及以及 的要求。的要求。 3 3、营养成分：、营养成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐 pH pH 特殊营养物质特殊营养物质 O O2 2 例如例如: :生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶) )以及以及氧气氧气、二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压等等

7、的要求。的要求。 培养霉菌时：酸性培养霉菌时：酸性培养细菌：中性或弱碱性培养细菌：中性或弱碱性COCO3 32 2- -、自养微生物异养微生物N2NH3等有机物中的氮（有机物中的氮（还还有尿素）有尿素）无机氮无机氮牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨圆褐固氮菌、硝化细菌和大肠杆菌圆褐固氮菌、硝化细菌和大肠杆菌分析氮源：分析氮源：3 3基本成分：基本成分：思考：微生物思考：微生物“吃吃”什么？什么？碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -葡萄糖、牛肉膏、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等蛋白胨等

8、自养微生物异养微生物氮源无机氮源：有机氮源：N2、NH4、NO3-等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源4.4.培养基的用途培养基的用途液体培养基：增菌、工业生产液体培养基：增菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、活固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、保藏菌种菌计数、保藏菌种半固体培养基：动力检测半固体培养基：动力检测培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如加凝固剂，如琼脂琼脂工业生产观察微生物的运动、观察微生物的运动、分类鉴定分类鉴定微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物含化

9、学成分不明确的天然物质工业生产工业生产培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质质, ,以抑制不需要的微生物的以抑制不需要的微生物的生长生长, ,促进所需要的微生物的促进所需要的微生物的生长生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂或化学药品或化学药品, ,用以鉴别不同用以鉴别不同种类的微生物种类的微生物鉴别不同种类微鉴别不同种类微生物生物选择培养基选择培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基5. 5. 配制原则配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适

10、宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型： 不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研自养型微生物与异养型微生物的培自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是养基的主要差别是( )( )A A碳源碳源 B B氮源氮源 C C无机盐无机盐 D D特殊营养物质特殊营养物质A思考：思考：1. 获得纯净培养物的关键获得纯净培养物的关键？2. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其无菌技

11、术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）旁栏思考）3. 消毒和灭菌有何不同？消毒和灭菌有何不同？4. 常用的消毒和灭菌方法有哪些？常用的消毒和灭菌方法有哪些？无菌技术还能有效避免操作者自身被微无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染生物感染。防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵二、无菌技术二、无菌技术思考：思考：1.无菌技术的关键是？无菌技术的关键是？2.无菌技术的目的是？无菌技术的目的是？防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵目的：防止实验室的培养物目的：防止实验室的培养物 ；同时避免同时避免 _ 。 被其他微生

12、物污染被其他微生物污染3.无菌技术的常用方法有？无菌技术的常用方法有？消毒和灭菌消毒和灭菌（）（）消毒定义：消毒定义：利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死大部份大部份致病微生物致病微生物的过程。的过程。2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别 以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到霉菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌之过程。之过程。（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的成一个椭圆

13、形的休眠体休眠体，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死亡。小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌孢又可以萌发，形成一个细菌细菌、原生动物、真菌和植物细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的等产生的一种有繁殖作用的生生殖细胞殖细胞。能直接发育成新个体。能直接发育成新个体。 恶

14、劣环境下，恶劣环境下，一个细菌产生一个芽孢一个细菌产生一个芽孢，条件适，条件适宜时重新成为一个细菌，数量没有增加，因此宜时重新成为一个细菌，数量没有增加，因此芽孢不是细菌的繁殖体，是休眠体芽孢不是细菌的繁殖体，是休眠体，因此称作，因此称作“芽胞芽胞”更为确切。更为确切。芽孢芽孢某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造的休眠体构造，称为芽孢。，称为芽孢。部分部分芽孢和孢子芽孢和孢子所有所

15、有芽孢和孢子芽孢和孢子煮沸消毒法、煮沸消毒法、 巴氏消毒法、巴氏消毒法、 化学药剂消毒法、化学药剂消毒法、 紫外线消毒法紫外线消毒法灼烧灭菌、灼烧灭菌、 干热灭菌、干热灭菌、 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌三维三维P11消毒的方法：消毒的方法：1、煮沸消毒法、煮沸消毒法:100煮沸煮沸5-6min2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 下煮下煮30min或或 80 下煮下煮15min3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%酒精、新洁尔酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4、紫外线或化学药物消毒、紫外线或化学药物消毒灭菌的方法：灭菌的方法：1、灼烧灭菌、灼烧灭

16、菌2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持下维持15-30min.（1 1）对实验操作的）对实验操作的空间、操作者的衣着和手空间、操作者的衣着和手，进行，进行 。（2 2）将用于微生物培养的）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基器皿、接种用具和培养基等器具进行等器具进行 . .（3 3）为避免周围环境中微生物的污染，）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作实验操作应在应在酒精灯火焰酒精灯火焰 附近进行附近进行。（4 4）实验操作时应）实验操作时应避免避免已经灭菌处理的材料用具已经灭菌处理的材料用具与周围的

17、物品与周围的物品 相接触相接触。 清洁和清洁和消毒消毒灭菌灭菌防杂菌污染包括以下几方面防杂菌污染包括以下几方面煮沸煮沸消毒消毒法：法：巴氏消毒法：巴氏消毒法：化学药剂：化学药剂：紫外线：紫外线：针对不耐高温的液体针对不耐高温的液体接种室、超净工作台接种室、超净工作台培养皿培养皿.吸管等玻璃器皿吸管等玻璃器皿耐高温、需保持干燥耐高温、需保持干燥灼烧灭菌：灼烧灭菌：干热灭菌：干热灭菌：高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：接种环等金属工具接种环等金属工具实验操作者的双手实验操作者的双手培养基培养基1 1、消毒方法、消毒方法2、灭菌方法、灭菌方法计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板三、微生物培养的实验

18、操作三、微生物培养的实验操作1、制备培养基、制备培养基制备培养基制备培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养三、实验操作三、实验操作 （一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌用于培养细菌）1 1计算、称量计算、称量2 2溶化溶化3 3调调pHpH：pH7pH76 64 4过滤：这一步可以省去。过滤：这一步可以省去。5 5分装：分装过程中注意不要使培养分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。三

19、角烧瓶容积的一半为宜。6 6加塞加塞7 7包扎包扎操作步骤操作步骤 8 8灭菌灭菌: : 将将5050mlml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为在压力为100100kPakPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌15153030minmin。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在菌箱内，在160160170 170 下灭菌下灭菌2 2h h。9 9倒平板倒平板: : 待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附近左右时

20、，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）倒平板。（倒平板操作见课本）2 2d d后观察平板，后观察平板，无杂菌污染才可用来接种无杂菌污染才可用来接种. . 1010无菌检查：无菌检查： 将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入3737的温室中培养的温室中培养24482448小时，以检查灭菌是否彻底小时，以检查灭菌是否彻底。1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才能用来倒平板。左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？你用什么办法来估计培养基的温度？用手触摸，刚刚不烫手时用手触摸，刚刚不烫手时2.2.为什么需要使锥形瓶的为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火

21、焰瓶口通过火焰？灼烧灭菌，防止瓶口的微生物的污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物的污染有关问题有关问题3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染答：防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染 避免培养基中水分过快蒸发。避免培养基中水分过快蒸发。4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：最好不要用这个平板培养微生物。答：最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在

22、皿盖与皿底之防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。间的培养基上滋生。2、纯化大肠杆菌、纯化大肠杆菌平板划线法平板划线法: :稀释涂布平板法稀释涂布平板法: :(1)(1)接接种种方方法法.连续划线，连续划线，.逐步稀释逐步稀释.梯度稀释，梯度稀释，.分别涂布分别涂布.将接种环放在火将接种环放在火焰上灼烧，直到焰上灼烧，直到接种环接种环_在在_旁冷旁冷却接种环，并却接种环，并打开棉塞打开棉塞 将试管口通过火焰将试管口通过火焰 .将已将已_的接种环伸的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液入菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙，右手左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入

23、平将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，板内，划划_条平行线，条平行线，盖上皿盖。注意盖上皿盖。注意不要划破培养基不要划破培养基。.将试管通过火将试管通过火焰，并塞上棉塞焰，并塞上棉塞 火焰火焰冷却冷却三至五三至五灼烧接种环，待其冷却后，从灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的第一区域划线的_开始开始往第二区域内划线。重复以上往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划操作，在三、四、五区域内划线。注意线。注意不要将最后一区的划不要将最后一区的划线与第一区相连线与第一区相连。末端末端烧红烧红将平板将平板_放放入培养箱中培养。入培养箱中培养。 倒置倒置 平板划线的操作方法 6 6支试管，分

24、别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器怎样得到稀释度为怎样得到稀释度为10101 1，10102 2，10103 3，10104 4，10105 5，10106 6的菌液？的菌液？将涂布器浸将涂布器浸在盛有酒精在盛有酒精的烧杯中的烧杯中 取少量稀释液滴取少量稀释液滴加到培养基表面加到培养基表面 待酒精燃尽后待酒精燃尽后冷却冷却8 810s10s 将沾有少量酒精将沾有少量酒精的涂布器在火焰的涂布器在火焰上引燃上引燃灼烧灼

25、烧用涂布器将菌液均匀用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀使涂布均匀稀稀释释涂涂布布平平板板法法将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。形成单个的菌落。浸浸稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度

26、稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法下图分别用什么接种法下图分别用什么接种法相同点：相同点：可以观察菌落特征，用于菌种的纯化可以观察菌落特征，用于菌种的纯化区别：区别： 平板划线法，不能计数；稀释涂布平板法，能计数平板划线法，不能计数；稀释涂布平板法，能计数3 3个划线平板个划线平板1 1个不划线平板个不划线平板（重复实验）（重复实验）（空白

27、对照）（空白对照）接种的培养基接种的培养基倒置放入倒置放入3737的的恒温箱中恒温箱中培养培养12h12h24h24h（3）培养）培养纯化大肠杆菌的实验是否需要设置对照实验？纯化大肠杆菌的实验是否需要设置对照实验？怎么确定所倒平板未被杂菌污染？怎么确定所倒平板未被杂菌污染？将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入3737的温室中培养的温室中培养24244848小时，观察是否有菌落存在以确定是否被污小时，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。染或灭菌是否彻底。有关问题有关问题(4)(4)实验结果观察实验结果观察: : 未接种的培养基表面是否有菌落生长？未接种的培养基表面是否有菌落生长？

28、菌落的形态、大小、颜色？菌落的形态、大小、颜色？培养培养12h12h和和2424小时后，观察到的小时后，观察到的结果相同吗？结果相同吗？1 1、临时保藏：接、临时保藏：接种到固体种到固体斜面斜面培养培养基，菌落长成后置基，菌落长成后置于于44冰箱冰箱保存。保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法固体斜面固体斜面这种方法保存的时间这种方法保存的时间不长，菌种容易被污不长，菌种容易被污染或产生变异染或产生变异。1.下列有关稀释涂布平板法的叙述下列有关稀释涂布平板法的叙述,错误的是错误的是 ( ) A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释首先将菌液进行一系列的梯度稀释 B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布然后将不同稀释度的菌液分别涂布 到琼脂固体培养基的表面到琼脂固体培养基的表面 C.适宜条件下培养适宜条件下培养 D.结果都可在培养基表