第四章 中药制剂的含量测定

1、药物分析教研室（Analysis of Chinese Preparation）1掌握样品的处理、分离和净化掌握样品的处理、分离和净化方法方法；滴定分析法、可见滴定分析法、可见-紫紫外分光光度法和外分光光度法和HPLC法的法的含含量计算方法。量计算方法。了解常用定量分析方法了解常用定量分析方法学习目的：熟悉含量测定的目的与意义以熟悉含量测定的目的与意义以及含量测定方法的效能指标及含量测定方法的效能指标2第一节第一节 含量测定的目的与意义含量测定的目的与意义 中药制剂质量优劣的标准中药制剂质量优劣的标准鉴别鉴别检查检查含量测定含量测定中药制剂的中药制剂的鉴别鉴别是研究某是研究某种原料药或成分的存

2、在与种原料药或成分的存在与否，从而判定药物的否，从而判定药物的真伪真伪中药制剂中药制剂含量测定含量测定是研究某是研究某种成分的含量高低是否符合种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的规定来判定药物的优劣优劣，是，是质量控制中的一项重要指标。质量控制中的一项重要指标。3 通过测定制剂中有效成分、毒性通过测定制剂中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药制剂的质量，质量优劣，以保证中药制剂的质量，达到临床用药安全、有效和中药制达到临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场的需要。剂进入国

3、际市场的需要。 中药制剂含量测定的意义中药制剂含量测定的意义4中药制剂含量测定的特点中药制剂含量测定的特点含量测定内容含量测定内容中药制剂中药制剂化学药品化学药品对象不同对象不同组成及成分复杂组成及成分复杂成分单一成分单一供试品溶液制备供试品溶液制备方法繁琐，大多需方法繁琐，大多需要净化分离要净化分离方法简单方法简单成分明确成分明确待测成分确定待测成分确定先根据中医药理论先根据中医药理论选择药味，再综合选择药味，再综合选择待测成分选择待测成分一般选择主一般选择主要成分要成分中药制剂与化学药品含量测定区别中药制剂与化学药品含量测定区别5样品处理的主要作用样品处理的主要作用释放被测组分，制成稳定试

4、样释放被测组分，制成稳定试样除去杂质，纯化除去杂质，纯化浓缩浓缩试样形式符合测定的要求试样形式符合测定的要求样品处理的主要步骤样品处理的主要步骤1. 样品的粉碎样品的粉碎2. 样品的提取样品的提取3. 样品的分离纯化样品的分离纯化6样品的粉碎样品的粉碎目的目的1. 取样均匀取样均匀 2. 提取完全提取完全粉碎设备粉碎设备粉碎机、研钵、匀浆机粉碎机、研钵、匀浆机 粒度大小合适粒度大小合适 样品粉末的分级（过筛）样品粉末的分级（过筛） 防止污染或损失防止污染或损失 仪器设备洁净仪器设备洁净 粉尘和较大颗粒的损失。粉尘和较大颗粒的损失。7样品的提取样品的提取 关键关键提取完全提取完全溶剂的选择溶剂的

5、选择水、酸水、碱水水、酸水、碱水亲水性的有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮亲水性的有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷 8常见的提取方法：常见的提取方法： 萃取法萃取法 浸渍法浸渍法 回流提取法回流提取法 连续回流连续回流提取法提取法 超声提取法超声提取法 水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法 超临界流体提取法超临界流体提取法 微波辅助萃取法微波辅助萃取法样品的提取样品的提取 9优缺点及适用范围：优缺点及适用范围：优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少取杂

6、质少缺点：费时（缺点：费时（12-24 h12-24 h）费溶剂（）费溶剂（10-5010-50倍）倍）样品的提取样品的提取 （一）冷浸法（一）冷浸法操作：操作：样品样品精密称定精密称定置容器内置容器内精密加入溶剂精密加入溶剂称定重量称定重量浸泡（浸泡（1224h）称重称重补足重补足重量量测定测定测定方法：测定方法：全部测定法：全部测定法：过滤过滤滤液滤液蒸干蒸干定容定容测定测定（残残渣需洗涤完全渣需洗涤完全）部分测定法部分测定法：过滤：过滤滤液滤液取若干体积测定取若干体积测定（不适（不适宜挥发性较大的溶剂）宜挥发性较大的溶剂）10 采用回流装置，用单采用回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴一

7、溶剂或混合溶剂于水浴上加热提取上加热提取优缺点及适用范围：优缺点及适用范围：提取效率高，提取时间短，提取效率高，提取时间短，为为0.52小时；提取小时；提取杂杂质较多质较多，不适用于热不稳，不适用于热不稳定或具有挥发性的成分定或具有挥发性的成分样品的提取样品的提取 （二）回流提取法（二）回流提取法（三）连续回流提取法（三）连续回流提取法万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定+HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定+甲醇，加热回流至提取液无色为止 用索氏提取装置，用索氏提取装置，利用遇热易挥发溶剂利用遇热易挥发溶

8、剂反复提取反复提取优缺点及适用范围：优缺点及适用范围：提取效率高，所需溶提取效率高，所需溶剂少，提取剂少，提取杂质较少，杂质较少，操作简便；受热易分操作简便；受热易分解的成分不宜使用解的成分不宜使用。11样品的提取样品的提取 （四）超声提取法（四）超声提取法原理：超声波的助溶作用原理：超声波的助溶作用优点：操作简便，提取速度快优点：操作简便，提取速度快 超声波可能引起供试品化学成分的改变超声波可能引起供试品化学成分的改变 需对超声频率、提取时间、提取溶媒等需对超声频率、提取时间、提取溶媒等进行考察进行考察12样品的提取样品的提取 （五）超临界流体提取法（五）超临界流体提取法（Supercrit

9、ical-fluid extractionSupercritical-fluid extraction，SFESFE）超临界流体超临界流体特殊的物质状态特殊的物质状态密度密度-d-d液体液体 溶解能力强溶解能力强粘度粘度- -气体气体 传质快，有利于待测组分传质快，有利于待测组分的扩散的扩散表面张力几乎为表面张力几乎为 0 0 浸润性能好浸润性能好13样品的提取样品的提取 超临界流体提取法超临界流体提取法密度受压力、温度的影响大密度受压力、温度的影响大 改变对溶质的溶改变对溶质的溶解能力解能力加入甲醇、氯仿、苯等改变极性加入甲醇、氯仿、苯等改变极性 提取不同极提取不同极性的成分性的成分优点：优

10、点：速度快、萃取效率高、方法准确度高、选速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，而且可避择性较高、节省溶剂、易于自动化，而且可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用谱等分析仪器直接联用。14样品的分离纯化样品的分离纯化 （一）沉淀法（一）沉淀法样品样品+沉淀剂沉淀剂 杂质杂质沉淀沉淀过滤过滤取滤液测定取滤液测定 待测组分待测组分沉淀沉淀重量法或溶解后测定重量法或溶解后测定蛇胆糖浆口服液蛇胆糖浆口服液含有大量糖，可用无水乙醇回流样含有大量糖，可用无水乙醇回流样品，冷后过滤，除糖以消除其干扰。品，冷后过滤，

11、除糖以消除其干扰。 复方益母草口服液中水苏碱的含量测定复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。杂质分离。 15样品的分离纯化样品的分离纯化 （二）蒸馏法（二）蒸馏法适用于具适用于具挥发性挥发性的待测组分，如挥发油、的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等小分子的生物碱、丹皮酚等最常用水蒸气蒸馏法最常用水蒸气蒸馏法共水蒸馏法共水蒸馏法通水蒸气蒸馏法通水蒸气蒸馏法水上蒸馏法水上蒸馏法利用盐析作用，提高蒸馏效果利用盐

12、析作用，提高蒸馏效果16样品的分离纯化样品的分离纯化 （三）液（三）液- -液萃取法液萃取法直接萃取法直接萃取法萃取剂的选择萃取剂的选择 亲脂性有机溶剂：如苯、氯仿或乙醚亲脂性有机溶剂：如苯、氯仿或乙醚弱亲脂性的溶剂：如乙酸乙酯、弱亲脂性的溶剂：如乙酸乙酯、正正丁醇等丁醇等多次萃取（多次萃取（3-43-4次）次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱调整水相酸度，提取有机酸、有机碱利用盐析作用，提高提取率利用盐析作用，提高提取率原理：原理：利用试样中被测成利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的（萃取剂）中的溶解度溶解度不不同，通过多次萃取达到分同，通过多次萃取达到

13、分离净化的目的。离净化的目的。17样品的分离纯化样品的分离纯化 （三）（三）液液- -液萃取法液萃取法离子对萃取法离子对萃取法 水相酸度的控制水相酸度的控制 离子对试剂的选择离子对试剂的选择BH+（水相）（水相）+ In-(水相水相) BH+In-（水相）（水相） BH+In-（有机相）（有机相） 生物碱生物碱离子对试剂：酸性染料，如离子对试剂：酸性染料，如BTB,BCG适合于高度电离的有机酸、适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取碱化合物的萃取18弱极性离子对弱极性离子对样品的分离纯化样品的分离纯化 （四）色谱法（层析法）（四）色谱法（层析法）分离原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换分离原理：

14、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱色谱、凝胶色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法：湿法装柱、干法装柱装柱方法：湿法装柱、干法装柱微柱色谱（固相萃取微柱色谱（固相萃取LSE） 19样品的分离纯化样品的分离纯化 LSE常用净化剂（填料）常用净化剂（填料）硅胶硅胶：酸性吸附剂酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层，适用于中性或酸性成分的层析，析，强烈保留碱性化合物。强烈保留碱性化合物。洗脱洗脱顺序：顺序：极性小极性小大大氧化铝氧化铝：带有碱性，分离一些碱性中草药成分，：带有碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、内酯等类型的化合物分离不宜用

15、于醛、酮、内酯等类型的化合物分离 中性、酸性氧化铝：适用于酸性成分的分离中性、酸性氧化铝：适用于酸性成分的分离20键合相硅胶键合相硅胶（C C1818或或ODSODS）: :分分开开脂溶性和水溶性成分脂溶性和水溶性成分操作程序：操作程序：柱的活化；上样；清洗；洗脱柱的活化；上样；清洗；洗脱洗脱洗脱顺序：顺序：极性极性大大小小大孔树脂大孔树脂分为极性（分为极性（丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物 ）和非极性（）和非极性（苯苯乙烯和二乙烯苯的共聚物乙烯和二乙烯苯的共聚物）型）型 使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗用酸、碱清洗 21聚酰胺聚酰胺：与溶质

16、形成与溶质形成氢键氢键而产生吸附作用，常用含而产生吸附作用，常用含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。硅藻土、纤维素硅藻土、纤维素：亲水型填料亲水型填料，以水基质液作为固以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相的的分配色谱分配色谱离子交换树脂离子交换树脂：用于除去样品中的：用于除去样品中的离子离子及及萃取萃取可离可离解化合物解化合物( (弱酸、弱碱药物弱酸、弱碱药物) )活性炭活性炭：非极性吸附剂非极性吸附剂使用前使用前需先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净需先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于，于8080

17、干燥干燥分开水溶性芳香族物质与脂肪族物质，单糖与多糖，氨分开水溶性芳香族物质与脂肪族物质，单糖与多糖，氨基酸与多肽基酸与多肽22样品的分离纯化样品的分离纯化 （五）固相微萃取（五）固相微萃取 （SPME） 集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法23样品的分离纯化样品的分离纯化 （六）消化法（六）消化法测定中药制剂中的无机元素测定中药制剂中的无机元素湿法消化湿法消化硝酸高氯酸法：适用于血，尿、组织等生物样适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏品和含动植物药制剂的破坏 对含氮杂环类有机物破坏不够完全对含氮杂环类有机物破坏不够完全 硝酸硫酸法

18、：与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。离子的测定，不宜采有此法。 硫酸硫酸盐法：常用于：常用于含砷或锑含砷或锑的有机样品的的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。破坏，破坏后得到三价砷或锑。 24样品的分离纯化样品的分离纯化 控制温度在控制温度在420420以下以下灰化完全，切勿弃去不易溶灰分灰化完全，切勿弃去不易溶灰分不适用于含易挥发性金属不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）（如汞、砷等，）有机样品的破坏。有机样品的破坏。 灼烧灰化(+Na2CO3/MgO)供试品供试品 灰分灰分干法消化干法消化25 重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法重量分析法

19、：挥发法、萃取法和沉淀法 一、化学分析法一、化学分析法适用于适用于含量较高含量较高的成分及的成分及无机成分无机成分的测定的测定滴定分析法滴定分析法 酸碱滴定法酸碱滴定法 沉淀滴定法沉淀滴定法配位滴定法配位滴定法氧化还原滴定法氧化还原滴定法 26重量分析重量分析挥发法：挥发法：又叫汽化或干燥法又叫汽化或干燥法如水分测定及干燥失重测定如水分测定及干燥失重测定萃取法：萃取法：又称为提取法或抽取法又称为提取法或抽取法如冰片散中冰片的含量测定如冰片散中冰片的含量测定沉淀法沉淀法：如苦参片中苦参总碱的含量测定：如苦参片中苦参总碱的含量测定27滴定分析滴定分析酸碱滴定法：酸碱滴定法：测定生物碱、有机酸、内酯

20、类测定生物碱、有机酸、内酯类 沉淀滴定法沉淀滴定法银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物四苯硼钠法：四苯硼钠法：+生物碱生物碱白色沉淀白色沉淀亚铁氰化钾法亚铁氰化钾法配位滴定法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸铵法）：测定法和硫氰酸铵法）：测定鞣质、生物碱及含鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等等矿物类制剂矿物类制剂的含量的含量氧化还原滴定法：氧化还原滴定法：酚类、糖类及矿物药中酚类、糖类及矿物药中Fe、As等成分的中药制剂；分为碘量法、高锰酸钾等成分的中药制剂；分为碘量法、高锰酸钾法和亚硝酸钠法等法和亚硝酸钠法等28二、紫外可见分光光度法二、

21、紫外可见分光光度法290.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号处理及显示信号处理及显示紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法紫外分光光度计基本构造紫外分光光度计基本构造30紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（一）单波长分光光度法（一）单波长分光光度法吸收系数法（CHP最为常用）最为常用）A=ECLA=ECL（朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：物质对物质对单色光单色光吸收特吸收特性与性与浓度、液层厚度浓度、液层厚度关系定律关系定律 ）对照品比较法对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（1001001010）标准曲线法要求：要求： 选择被测成分的选择被测成

22、分的max为测定波长为测定波长，而共存，而共存组分在此波长处基本无吸收，并控制供试液的组分在此波长处基本无吸收，并控制供试液的吸收度读数在吸收度读数在0.3-0.7之间之间31吸收系数法吸收系数法 测定供试品溶液在规定波长处的吸收度测定供试品溶液在规定波长处的吸收度A A，根据根据A=clA=cl，若，若l l和吸光系数和吸光系数或或 已知，已知，即可求出被测物的浓度。即可求出被测物的浓度。 %11cmElEAClACcm%11或%11cmE例例: :小檗碱溶液在小檗碱溶液在345nm345nm处的处的 为为728728，现，现测的某小檗碱溶液在测的某小檗碱溶液在345nm345nm出的吸收度

23、为出的吸收度为0.58240.5824，计算该小檗碱溶液的浓度。，计算该小檗碱溶液的浓度。32标准曲线法标准曲线法 从标准品吸光度从标准品吸光度- -浓度曲线求得样品溶液的浓度浓度曲线求得样品溶液的浓度 KCAKCA或对照品对照法对照品对照法在一定线性范围内根据在一定线性范围内根据Lambert-Beer Lambert-Beer 定律溶液定律溶液的浓度和吸光度存在以下关系的浓度和吸光度存在以下关系样标样标CCAA33紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（二）计算分光光度法（二）计算分光光度法双波长分光光度法双波长分光光度法（等吸收点法、系数倍率法）（等吸收点法、系数倍率法）三波长法三波长法导

24、数光谱法导数光谱法 一般应用于供试品溶液中含有一般应用于供试品溶液中含有2 2中或中或2 2种以上种以上的组分的含量测定。的组分的含量测定。差示光谱法差示光谱法 利用比样品浓度稍低的标准品作为利用比样品浓度稍低的标准品作为空白空白, ,进行测定及计算的方法进行测定及计算的方法. .34为干扰组分的吸收光谱为待测组分的吸收光谱为混合组分的吸收光谱关键步骤：选择1和2的基本条件干扰组分在1 1和2 2处应具有相同的吸收度待测组分在这两个波长处的吸收光度差值应足够大波长波长(1、2)LCAAAbbbbb)(1212双波长法等吸收点法双波长法等吸收点法a bc计算分光光度法35分析步骤 选择双波长（1

25、、2） 绘制标准曲线 对浓度作图（回归） 样品测定 1、2，分别测定1及2 应用条件：吸收曲线有峰和谷双波长法等吸收点法双波长法等吸收点法a bc计算分光光度法36紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法紫外光谱法中对仪器和试剂的要求紫外光谱法中对仪器和试剂的要求（1 1）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度的）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度的准确性、杂散光等。准确性、杂散光等。 （2 2）对溶剂的要求：）对溶剂的要求：用用1cm1cm石英池盛装溶剂，以空气为石英池盛装溶剂，以空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度在空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度在220nm220nm2

26、40nm240nm范围内不得超过范围内不得超过0.400.40；在；在241nm250nm241nm250nm范围内不得范围内不得超过超过0.200.20；在；在251nm300nm251nm300nm的范围内不得超过的范围内不得超过0.100.10；300nm300nm以上不得超过以上不得超过0.050.05。37三、薄层扫描法（三、薄层扫描法（TLCSTLCS） 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-tA-t或或F-lF-l曲曲线。根据薄层扫描的测定方式分为线。根据薄层

27、扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法和和薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法二种方法。二种方法。38薄层扫描法（薄层扫描法（TLCSTLCS）1.1.薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法 光源：光源：钨灯和氘灯；钨灯和氘灯； 灵敏度：灵敏度：在在200-800nm200-800nm波长范围内选择合适波波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达长进行测定，其灵敏度可达ngng级；级； 适用范围：适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。样品组分。39薄层扫描法（薄层扫描法（TLC

28、STLCS） 2.2.薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法 光源：光源：氖灯或汞灯氖灯或汞灯; ; 灵敏度：灵敏度：最低可测到最低可测到10-50pg;10-50pg; 适用范围：适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。处理后可产生荧光的物质的测定。40四、气相色谱法（四、气相色谱法（GCGC） 基本原理基本原理 气相色谱法（气相色谱法（GCGC）是将气化后的试样由）是将气化后的试样由载气载气（流动相）带入色谱柱，根据各组分在流动相和（流动相）带入色谱柱，根据各组分在流动相和固定相间作用的不同而分离，并随载气依次流出固定相间作用的不同而分离，并随

29、载气依次流出色谱柱，经检测器检测，利用色谱柱，经检测器检测，利用保留值保留值进行定性，进行定性，色谱峰面积或峰高色谱峰面积或峰高进行定量的分析方法。进行定量的分析方法。 41气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 基本原理基本原理 42气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 基本概念基本概念 色谱峰：由电信号强度对时间作图所色谱峰：由电信号强度对时间作图所绘制的曲线。（正态分布曲线）绘制的曲线。（正态分布曲线） 不正常的色谱峰：前延峰、拖尾峰不正常的色谱峰：前延峰、拖尾峰 常用定量参数：峰高、峰面积常用定量参数：峰高、峰面积 常用定性参数：峰位常用定性参数：峰位 用于衡量柱效：峰宽用于衡量柱效：峰宽

30、43气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 基本概念基本概念 基线：在操作条件下，没有组分流出基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线，横轴直线。时的流出曲线，横轴直线。 保留值保留值 保留时间保留时间t tR R 保留体积保留体积V VR R 死时间死时间t t0 0 死体积死体积V V0 0 调整保留时间调整保留时间ttR R 调整调整保留体积保留体积VVR R 4445气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 塔板理论塔板理论 塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在移动，在每一个塔板内组

31、分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好板数越多，则其分离效果就越好 46气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 柱效指标柱效指标理论塔板数理论塔板数n n及理论塔板高度及理论塔板高度H H 衡量色谱柱分离效果的参数：衡量色谱柱分离效果的参数：理论塔板数理论塔板数n n。10105 5-10-106 6 在一定高度内，组分可以在两在一定高度内，组分可以在两项中达到分

32、配平衡，次高度为理论项中达到分配平衡，次高度为理论塔板高度。塔板高度。 47气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 柱效指标柱效指标理论塔板数理论塔板数n n及理论塔板高度及理论塔板高度H H 理理HLn理理或nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理48气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 柱效指标柱效指标 1b2b1R2R)(2WWttR 指待测峰与其他峰、内标峰或特定指待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间的分离情况。的杂质对照峰之间的分离情况。分离度的计算分离度的计算完全未分开相邻两峰完全分离标准基本分离0 . 15 . 10 . 1RRR衡量色谱分离条件优劣的参

33、数衡量色谱分离条件优劣的参数49气相色谱法（气相色谱法（GCGC）适用范围适用范围 挥发油及其它挥发性组分挥发油及其它挥发性组分：冰片、桉叶素、樟：冰片、桉叶素、樟脑、丁香酚、龙脑等。脑、丁香酚、龙脑等。 中药制剂含水量、含醇量中药制剂含水量、含醇量系统适用性试验系统适用性试验1.1.理论塔板数理论塔板数 n5.54(tR/W1/2)2 不得低于最小理论塔板数；柱长，柱填充、不得低于最小理论塔板数；柱长，柱填充、载体性能等有影响。载体性能等有影响。 50气相色谱法（气相色谱法（GCGC）系统适用性试验系统适用性试验2.2.分离度分离度 R=2(tR1-tR2)/(W1+W2) R1.5 R1.

34、5（两峰完全分离）（两峰完全分离）3.3.重复性重复性 RSD2.0 RSD2.0 (n=5)(n=5)4.4.拖尾因子拖尾因子 T=W0.05h/2d1(d(d1 1峰极大至峰前沿之间的距离峰极大至峰前沿之间的距离) ) 峰高法定量时峰高法定量时 1.05T0.95 1.05T0.95 51气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择实验条件的选择一、固定相的选择一、固定相的选择气气-液分配色谱柱液分配色谱柱固定液的选择固定液的选择按相似相溶原则选择按相似相溶原则选择按组分性质的主要差别选择按组分性质的主要差别选择 52气相色谱法（气相色谱法（GCGC）按相似相溶原则选择按相似相溶原则

35、选择 固定液与被测组分极性固定液与被测组分极性“相似相溶相似相溶” 非极性组分非极性组分选非极性固定液，选非极性固定液， 按沸点顺序出柱，低沸点的先出柱按沸点顺序出柱，低沸点的先出柱 中等极性组分中等极性组分选中等极性固定液，选中等极性固定液， 基本按沸点顺序出柱基本按沸点顺序出柱 强极性组分强极性组分选极性固定液选极性固定液 按极性顺序出柱，极性强的后出柱按极性顺序出柱，极性强的后出柱53气相色谱法（气相色谱法（GCGC）按组分性质的主要差别选择按组分性质的主要差别选择 组分以沸点差别为主组分以沸点差别为主 选非极性固定液选非极性固定液 按沸点顺序出柱、沸点低的先出柱按沸点顺序出柱、沸点低的

36、先出柱 组分的极性差别为主组分的极性差别为主 选极性固定液选极性固定液 按极性强弱出柱、极性弱的先出柱按极性强弱出柱、极性弱的先出柱例：苯（例：苯（80.10C），环己烷（），环己烷（80.70C）选非极性柱选非极性柱 分不开；分不开；选中强极性柱选中强极性柱 较好分离，环己烷先出柱较好分离，环己烷先出柱54气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择实验条件的选择一、固定相的选择一、固定相的选择2.气气-固分配色谱柱固分配色谱柱固定相的选择固定相的选择吸附剂：活性炭（非极性）吸附剂：活性炭（非极性） 硅胶，硅胶，AlAl2 2O O3 3（极性，吸附力强）（极性，吸附力强） 分子筛：吸

37、附分子筛：吸附+ +分子筛分子筛高分子多孔微球：高分子多孔微球：GDXGDX有机合成高分子聚合物、有机合成高分子聚合物、吸附吸附+ +分配机制分配机制 55气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择实验条件的选择二、柱温的选择二、柱温的选择 沸点 固定液配比 %柱温高（300-400）低 1-5200-250200-3005-10150-180100-20010-15平均 2/3低高 15-2550以下根据样品的沸点选择56气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择实验条件的选择三、载气的选择三、载气的选择柱效、柱压、灵敏度柱效、柱压、灵敏度 流速流速20-80mL/min20

38、-80mL/min低流速低流速 氮气氮气* *高流速高流速 氢气氢气 氦气氦气热导检测器热导检测器 氢气氢气 氦气氦气氢焰检测器、电子捕获检测器氢焰检测器、电子捕获检测器 氮气氮气 57气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择实验条件的选择 四、其他条件四、其他条件气化室（进样口）温度：气化室（进样口）温度： 不超过沸点不超过沸点50 50 高于柱温高于柱温30-50 30-50 检测室温度：检测室温度： 高于柱温高于柱温3030左右左右进样量：进样量： 气体气体0.1-1mL 0.1-1mL 液体液体 0.2-1L0.2-1L 58气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 实验条件的选择

39、实验条件的选择 五、检测器五、检测器热导检测器（热导检测器（TCDTCD）氢焰离子化检测器（氢焰离子化检测器（FIDFID）氮磷检测器（氮磷检测器（NPDNPD）电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECDECD） 59气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法峰面积的测量峰面积的测量正常峰正常峰不对称峰不对称峰自动求和（自动积分仪或色谱工作站）：直自动求和（自动积分仪或色谱工作站）：直接给出接给出A A，h h，W W1/21/2 21605. 1WhA)(21605. 185. 015. 0WWhA60气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 归一化法归一化

40、法外标法外标法 校正因子内标法校正因子内标法 标准溶液加入法标准溶液加入法常用的定量分析方法常用的定量分析方法61气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法定量校正因子定量校正因子 定量）（或不可以直接用同一检测器响应不同相同量的不同物质对于不同质对于不同检测器响应前提：相同量的同种物iiiACm62气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法绝对校正因子绝对校正因子 iiiiiiAmfAfm关）分性质、仪器灵敏度有绝对校正因子（与组if的量或质量进入检测器中的物质im63气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法相对校正因子相对校正因子 s

41、iisssiisimimAmAAmAmfff作条件变化无关）相对校正因子（与操mifsiAAsi和测混匀进样基准物纯品过程：精称siismissiisimmAAfAfAfmm64气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法校正因子内标法校正因子内标法校正因子的计算校正因子的计算取内标物和待测组分的对照液进样测定取内标物和待测组分的对照液进样测定A A取含有内标物的供试品溶液进样测定取含有内标物的供试品溶液进样测定A A RRSSSSRRsRCACAAWAWfff/SsXXCAAfC65气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 对内标物的基本要求1.1.内标物

42、是原样品中不含有的组分内标物是原样品中不含有的组分2.2.内标物的保留时间应与待测组分相近，但彼此内标物的保留时间应与待测组分相近，但彼此能完全分离能完全分离(R1.5)(R1.5)3.3.内标物必须是纯度合乎要求的纯物质内标物必须是纯度合乎要求的纯物质66气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 内标法的优缺点优点优点定量结果与进样量的重复性无关定量结果与进样量的重复性无关与其他组分是否出峰无关与其他组分是否出峰无关用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量测定的结果较为准确测定的结果较为准确缺点缺点 操作程序较为麻烦操作程序较为麻烦 寻

43、找合适的内标物有困难寻找合适的内标物有困难67气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法归一化法归一化法 前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰峰 依据：组分含量与峰面积成正比依据：组分含量与峰面积成正比 %100%100%11nniiiiiiiiifAfAfAfAfAfAC%100%100%1niiiiiAAAAAAC同系物或结构异构体68气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法外标法外标法 以待测组分纯品为对照物，与试样中待测以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法组分的响应

44、信号相比较进行定量的方法a a 工作曲线法工作曲线法b b 外标一点法外标一点法c c 外标两点法外标两点法 69气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法外标法外标法 b b 外标一点法外标一点法 一种浓度对照物对比样品中待测组分含量 前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近 RRAAxCCx70气相色谱法（气相色谱法（GC） 定量分析方法定量分析方法外标法外标法 c c 外标两点法外标两点法 前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度测浓度 71气相色谱法（气相色谱法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法标准溶液加入法标准溶液加入法

45、精密称量被测组分的对照品，配置成适精密称量被测组分的对照品，配置成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，依据内标法或外标法入到供试品溶液中，依据内标法或外标法测定含量，再扣除加入对照品的含量，即测定含量，再扣除加入对照品的含量，即得。得。 AxAisCxCxCx72五、高效液相色谱法（五、高效液相色谱法（HPLC） 特点：高柱效、高灵敏度、高选择性、分析速特点：高柱效、高灵敏度、高选择性、分析速度快及应用范围广度快及应用范围广 适用于测定适用于测定 挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型

46、化合物，如蛋白质、氨基酸、生物合物及离子型化合物，如蛋白质、氨基酸、生物碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类。碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类。 73高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 基本原理基本原理 以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。和技术基础上建立的一种液相色谱法。 1. 1.塔板理论塔板理论 2. 2.速率理论速率理论 理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理74项目项目HPLCHPLCLCLC柱长柱长/cm/cm10-2510-25100-200100-200内径内径/

47、mm/mm2-102-1010-2510-25压力压力/MP/MP2-202-200.001-0.10.001-0.1柱效柱效/n/m/n/m2 2* *10103 3-5-5* *10103 32-502-50进样量进样量/g/g1010-6-6-10-10-2-21-101-10分离、分析时间分离、分析时间/h/h0.05-1.00.05-1.01-201-20装置装置自动化自动化手工手工检测方法检测方法检测器检测检测器检测收集后定性定量收集后定性定量HPLC与与LC的比较：的比较：75项目项目HPLCHPLCGCGC进样方式进样方式溶液溶液气化或裂解气化或裂解流动相流动相液态液态气态气态

48、压力压力/MP/MP2-202-200.1-0.50.1-0.5柱温柱温常温常温常温常温-300-300分离原理分离原理吸附、分配、离子吸附、分配、离子交换、化学键合交换、化学键合吸附、分配吸附、分配应用范围应用范围大部分物质大部分物质易挥发、热稳定易挥发、热稳定HPLC与与GC的比较：的比较：76高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 色谱柱的选择色谱柱的选择 大多数药物可用大多数药物可用C18反相（反相（ODS）柱）柱加以分加以分离测定；也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、离测定；也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；氰基柱）或硅胶吸附色谱

49、柱等； 解离药物解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；离子交换色谱分离测定； 脂溶性药物异构体脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。附色谱柱。根据被分离物质的化根据被分离物质的化学结构、极性和溶解学结构、极性和溶解度等因素进行选择。度等因素进行选择。77高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 流动相的选择流动相的选择 反相键合相色谱反相键合相色谱常用流动相：常用流动相： 流动相流动相常用溶剂常用溶剂适用范围适用范围部分含水溶剂部分含水溶剂甲醇甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水水系

50、统系统用于分离中等极性、用于分离中等极性、弱极性药物弱极性药物非水溶剂非水溶剂乙腈乙腈- -二氯甲烷、二氯甲烷、甲醇甲醇- -四氢呋喃等四氢呋喃等用于分离疏水性物质用于分离疏水性物质缓冲溶液缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可用于可溶于水并具可解离特性的化合物解离特性的化合物78高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 流动相的选择流动相的选择 正相键合相色谱正相键合相色谱： 常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的溶剂作为性较大的溶剂作为极性调节剂极性调节剂（如异丙

51、醚），（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度； 常采用二元以上的混合溶剂系统。常采用二元以上的混合溶剂系统。 79高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 洗脱方式洗脱方式 等度洗脱：等度洗脱：同一分析周期内流动相的组成保同一分析周期内流动相的组成保持恒定，适用于组分数较少、性质差别不大持恒定，适用于组分数较少、性质差别不大的样品。的样品。 梯度洗脱：梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动在一个分析周期内程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和相的组成（如溶剂极性、离子强度和pHpH值等值等），适用于分析组分数

52、多、性质相差较大的），适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品，使所有组分在适宜条件下复杂混合物样品，使所有组分在适宜条件下获得分离。获得分离。 80高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 检测器检测器 UVUV或或UVDUVD：被测物有紫外吸收，流动相的截止：被测物有紫外吸收，流动相的截止波长小于检测波长。波长小于检测波长。 FDFD：灵敏度高，荧光物质检测。：灵敏度高，荧光物质检测。 ELSDELSD：挥发性低于流动相的组分，糖类、高：挥发性低于流动相的组分，糖类、高分子化合物等；不能用含盐流动相。分子化合物等；不能用含盐流动相。 ECDECD、RI

53、DRID、CLDCLD等等 81检测器检测器特点特点最低检测限最低检测限适用范围适用范围紫外检测器紫外检测器（UVUV或或UVDUVD）: :可变可变波长型二极波长型二极管阵列检测器管阵列检测器 检测有紫外吸收的物质检测有紫外吸收的物质; ; 灵敏度较高灵敏度较高, ,噪音低噪音低, ,线线性范围宽性范围宽, ,对流速和温度对流速和温度波动不灵敏波动不灵敏, ,可用于梯度可用于梯度洗脱洗脱. .1010-7-7-10-10-12-12g g用于芳烃、稠环芳用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、核酸、甾体激素、羰基及其化合物等羰基及其化合物等荧光检测器荧光检测器(FD)

54、 (FD) 用于能产生荧光或其衍用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质生物能发荧光的物质; ;灵敏度高于紫外检测器灵敏度高于紫外检测器1 11010-10-10g/mlg/ml用于氨基酸、多环用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等体化合化物及酶等蒸发光散射检蒸发光散射检测器测器(ELSD)(ELSD)属通用型检测器属通用型检测器, ,理论理论上可用于挥发性低于流动上可用于挥发性低于流动相的任何样品组分相的任何样品组分; ; 检检测灵敏度较低测灵敏度较低, ,适用于流适用于流动相能挥发的色谱洗脱动相能挥发的色谱洗脱, ,不能用含缓冲盐的流动相不能用含缓冲盐的流动相用于检

55、测糖、高分用于检测糖、高分子化合物、高级脂子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十三酯及甾体等几十类化合物类化合物82电化学检测器电化学检测器(ECD)(ECD)用于能氧化、还原的有用于能氧化、还原的有机物质的检测，尤其适机物质的检测，尤其适用于痕量组分的分析用于痕量组分的分析1 11010-12-12g/mlg/ml适用生物胺、酚、适用生物胺、酚、羰基化合物、巯羰基化合物、巯基化合物等基化合物等示差折光检测器示差折光检测器(RID)(RID)通用型检测器通用型检测器, ,利用利用组分与流动相折射率之组分与流动相折射率之差进行检测差进行检

56、测. . 稳定性稳定性好好, ,操作方便操作方便. .灵敏度灵敏度低低, ,受环境温度、流动受环境温度、流动相组成等波动的影响大相组成等波动的影响大, ,不适合梯度洗脱不适合梯度洗脱1010-8-8g/mlg/ml尤其适合于糖类尤其适合于糖类的检测的检测化学发光检测器化学发光检测器(CLD)(CLD)高选择性、高灵敏度高选择性、高灵敏度的新型检测器的新型检测器. . 设备设备简单简单, ,自身发光自身发光, ,无需光无需光源源, ,价格便宜价格便宜PgPg级级(10(10-12-12) )用于分析微量脂用于分析微量脂质、核酸、生物质、核酸、生物胺等胺等83高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPL

57、C）实验条件的选择实验条件的选择 HPLCHPLC前处理前处理 流动相的处理：流动相的处理：溶剂的纯化溶剂的纯化：色谱纯；：色谱纯；流动相脱气：流动相脱气：常用超声波振荡脱气；常用超声波振荡脱气； 过滤：过滤：防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，采用处的微孔垫片，采用0.45m0.45m以下微孔滤膜过以下微孔滤膜过滤，滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种滤，滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。84 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择实验条件的选择 HPLCHPLC前处理前处理 样品的处理：样品的处理：待测组分的提取待测组分的提取溶剂的挥

58、发：溶剂的挥发：自然挥散或在氮气流下吹干自然挥散或在氮气流下吹干，适用于，适用于小体积样品和挥发性溶剂；小体积样品和挥发性溶剂；减压蒸发减压蒸发，适用于热不稳，适用于热不稳定样品；定样品；冷冻干燥冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。，适用于受热易分解破坏的样品。 滤过滤过：样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子滤器过滤，以除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。杂质。 85高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）HPLCHPLC法分类及方法法分类及方法l分类分类 一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC

59、） 二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLCLLC） 三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPCBPC） 86高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC） 固定相：固定相：硅胶、薄膜型氧化铝、聚酰胺、高分硅胶、薄膜型氧化铝、聚酰胺、高分子多孔小球等。子多孔小球等。 流动相：流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、烷烃等。烷烃等。 出柱顺序：出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱。出柱。 87高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 二、液液分配色谱法（二、液

60、液分配色谱法（LSCLSC） 固定相：载体固定相：载体+ +固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）内压大、易流失、不实用内压大、易流失、不实用 正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱; ; 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 固定相极性固定相极性出柱顺序：出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱后出柱 适用：适用：非极性非极性- -中等极性组分中等极性组分 90 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 正相键