细胞工程复习

1、绪论细胞工程的特点前沿性；争议性；综合性；应用性细胞工程：细胞工程是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。细胞培养： 指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使期生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术.第一章动物细胞工程实验室5部分：（1）无菌操作室；（2）培养与观察室；（3）制备室；（4）储藏室；（5）清洗和灭菌室CO2培养箱：CO2培养箱适合开放式或半开放式的细胞培养，能恒定地提供定量CO2,保持细胞培养时PH的稳定，通常使用条件为37，5CO2。

2、第三章细胞生长曲线：是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲线。细胞贴壁率:又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐（MTT）还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。体外活体染色：就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的细胞或组织进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法

3、。污染的排除可使用用抗生素，预防用药一般用双抗生素(青霉素加链霉素)。第四章体外培养细胞的分型：1、贴壁性细胞：上皮细胞型；成纤维细胞型；游走细胞型；多形型细胞2、悬浮型细胞培养细胞的生长特点：贴附接触抑制密度抑制接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，数量仍在增多，但当细胞密度进一步增大时，培养液中营养成分的减少，细胞营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。细胞系：指由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体

4、。细胞株：指细胞系经进一步的克隆化，得到的由单一细胞组成的群体。细胞系的生长过程：原代培养期传代期衰退期每代细胞的生长过程：潜伏期指数生长期停止期培养细胞的遗传学特征：1、核型变化（当细胞发生转化或成为肿瘤细胞时，大多失去2倍体核型，成为多倍体或异倍体。）；2、永生化和恶变（细胞永生化也称不死性，是细胞获得持续生长增殖能力的特性。而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致瘤性。）；3、细胞性别（女性细胞的巴氏体和男性的Y小体在培养细胞群中都可检测到。说明培养细胞仍保持着性别特征。）细胞培养的常用液体：水、平衡盐溶液、消化液（胰蛋白酶、EDTA-Na及胶原酶溶液）、消化酶抑制液、PH调整液。原代

5、培养：是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 原代细胞取材的基本要求：1、取材要注意新鲜和保鲜；2、应严格无菌；3、防止机械损伤；4、去除无用组织和避免干燥；5、应注意组织类型、分化程度、年龄等；6、作好记录组织细胞分离：1、机械法离心分离法切割分散法机械分散法2、消化法 （1）酶法 胰蛋白酶消化法；胶原酶消化法；（2）非酶法 螯合剂消化法细胞培养的方法：（1）组织块培养法；（2）单层细胞培养；（3）悬浮细胞培养。细胞的冻存，复苏：1细胞的冻存 消化细胞（同前），将细胞

6、悬液收集至离心管中。 1000 rpm离心10分钟，弃上清液。 沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 贴上标签，写明细胞种类、冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 按下列顺序降温：室温4（20分钟）冰箱冷冻室（30分钟） 低温冰箱（-30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。2 细胞的复苏 将冻存于液氮中的冻存管取出（取出时应戴好手套和防护眼镜），迅速放入37-40水浴中使其在1min内融化。 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足生长液后

7、，置37培养。待细胞贴壁（约4 h）后，换培养液一次。 或取出细胞悬液至离心管中，补加10 ml培养液，500-1000r/min低速离心5 min，去上清，用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培养，次日后更换一次培养液。 待细胞长成单层后即可传代。第五章细胞的融合：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程，又称为体细胞杂交。细胞融合的三种方式：1、PEG介导的细胞融合。优点：基于PEG的诱导融合优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制 。缺点：是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害 。2、细胞电融合。优点：融合率高，达7080，甚

8、至100。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。3、病毒诱导融合。优点：用灭活的仙台病毒诱导细胞融合率较高，对各种动物细胞均适宜，容易培养；缺点制备过程比较烦琐。而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。HAT的选择原理：HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。（原理见下图，详见书本77页）第六章胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，利用人工方法影响、改变动物胚胎品质发育和进程的一种生物技术。主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。精子获能：精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在

9、附睾中成熟及在雌性生殖道内停留一段时间，才具有使卵受精的能力，这种现象称精子获能。 顶体反应：精子在同卵子表面接触或与卵膜分泌的物质相遇后，精子的顶体就会发生一系列的变化。体外受精：就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。滋养层细胞：外层发育成为胎盘的细胞。 内细胞团：在胚泡胚极一端，能够发育成为胚胎主体的一团细胞 。胚胎移植：一般是针对早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宫中取出，经过人为处理，可以再送入子宫的过程，这是胚胎生物工程的基本技术。超数排卵：在母畜发情周期的适当时间用人工的方法促使其有更多的卵泡发育、成熟、排卵的一项技术。同期发情：胚胎移植时，供体胚

10、胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情。胚胎的采集有手术法和非手术法。第七章干细胞： 干细胞是一种具有自我更新和分化能力的细胞。干细胞的分类：1、按分化潜能大小来分类：全能性干细胞，多能性干细胞，专能干细胞2、根据来源来分：来源于胚胎（胚胎干细胞，胚胎性生殖细胞） 来源于成体（成体干细胞）胚胎干细胞：是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。胚胎干细胞的生物学特性：（一）、 ES细胞形态结构和核型圆形或椭圆形，体积较小，核质比较大，核中多为常染色质。具有正常稳定的二倍体核型。体外分化抑制培养时呈集落生长，形似鸟

11、巣，细胞紧密堆积，难以看到清晰细胞轮廓，但是集落边界清晰。（二） 、 ES细胞细胞高度的分化潜能和分化的调控1、具有发育完整个体的能力，全能性表现在： 形成畸胎瘤； 形成类胚体； 直系分化； 形成嵌合体2、分化的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。3、 ES细胞特异性物质的表达：碱性磷酸酶（AKP）；胚胎阶段特异性细胞表面抗原( SSEA-1) ；OCT-4转录子；端粒酶活性ES细胞的鉴定：1、形态学检测；2、核型分析；3、碱性磷酸酶（AKP）活性的检测；4、SSEA-1免疫荧光标记（间接免疫荧光法）；5、OCT-4转录子表达产物的检测；6、分化能

12、力的检测组织工程：指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机理，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。 第八章克隆：指细胞、植物、动物或人的精确的遗传复制。用无性方式产生的后代群体。核移植技术：将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制。治疗性克隆方法：1、首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞；2、在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES 细胞；3、对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究；4、将定向分化后的细胞移植给病人。 核移植技术的应用：1

13、、 制备转基因克隆动物，进行生物药物的生产。2、 培育优良畜种，扩大优良种群。3、 开展异种动物克隆，拯救濒危动物。4、 与干细胞技术结合，开展治疗性克隆。5、 利用核移植技术研究生物学的基本问题。第十一章植物细胞工程的应用：1、植物育种；2、植物快速无性繁殖和脱毒；3、种质保存；4、医药和食品工业化生产。植物组织培养：在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。细胞分化：细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。 脱分化：细胞分化是可逆的，分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。细胞再分化：

14、即脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。再分化可以通过两种不同途径实现：一种是胚胎发生，形成双极性的胚状体，胚状体是对应于种子胚而言，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构进而获得再生植株的方法；另一种是器官发生，形成单极性的芽或根，进一步发育成完整植物体的过程，由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。生长素/细胞分裂素比例的高低，高时有利于根的形成和愈伤组织的形成；适中时有利于根的分化；低时有利于芽的形成。植物组织培养的材料处理：1、清洗；2、灭菌；3、接种。植物

15、培养基的六大成分：水，无机盐，有机物，植物激素，培养基支持材料，辅助性物质。第十二章外植体：由活体植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）不定芽：除顶芽和腋芽以外，任何其他器官或组织产生的芽称为不定芽。快繁的过程（论述）植物的快繁：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性状一致的个体的方法。也称之为微繁。快繁的过程有5步：1、无菌母株制备（1）表面清洗：从田间取回具有顶端分生组织和次生分生组织的嫩枝，视其清洁程度用自来水

16、冲洗或不洗。（2）表面灭菌：然后用消毒剂进行表面灭菌（注意浸泡、冲洗和适当加长消毒时间）。（3）接种培养：把灭菌后的嫩枝，在无菌条件下切割成带一两芽的茎段，接种在预先配制好的培养基上，诱导不定芽形成。如果培养基适宜，会在1个芽眼处形成多个芽体，称为丛芽（不定芽丛）。2、不定芽的增殖（1）腋芽形成途径：即选取已经发育成熟的顶芽和腋芽，连同它们的短枝经表面灭菌后，在无菌条件下培养，诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。（2）器官发生途径：从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。（3）胚状体形成途径：由植物器官、组织和细胞培养而直接发生类胚结构，最后以胚状体成苗的方式。3、完整小植株的形成：将继代增

17、殖的幼嫩小植株，转移至生根培养基中，诱导根的分化和根系的形成，最终成为具有根、芽（生长点）的完整小植株。4、小植株的驯化和移栽：通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。 5、再生植株的鉴定（1）细胞学鉴定：对再生株群体抽样检查根尖染色体数目以及减数分裂期的染色体行为。（2）形态鉴定：在田间对再生株的植物学性状进行鉴定，发现变异株再作细胞学鉴定。植物脱毒的原理：（一）微茎尖培养法原理：感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，越靠近生长点，病毒浓度越低，生长点(约0.11.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能

18、通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。针对其机理提出了多种解释：能量竞争；传导抑制；激素抑制；酶缺乏；抑制因子（二）珠心组织培养法原理：珠心组织没有微管束，一般不带病毒；（三）热处理法的原理：植物组织比病毒耐受高温。第十三章单倍体育种：将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选优良个体，直接繁育成新品种，或具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。植物小孢子发育过程：1、四分体孢子时期；2、单核期；3、双核期花药和花粉培养的不同点：花药培养不需要进行游离花粉的处理，不需要特殊的培养方法，而花粉培养法需要对花粉进行收集，需要特别的培养方法。

19、但是花药体细胞会形成二倍体植株对后代要进行进一步的筛选，而花粉培养法排除了体细胞的影响。花药培养的优缺点：优点：1、不需要进行游离花粉的处理；2、不需要特殊的培养方法。缺点：1、花药体细胞形成二倍体植株；2、对后代要进行进一步的筛选。花粉培养的优缺点：优点：1.、排除了体细胞的影响；2、花粉较小，所需器皿和培养空间较小；3、花粉可以成为基因工程的受体。缺点：1、需要对花粉进行收集；2、需要特别的培养方法单倍体植物的染色体加倍的方法：（1）小苗浸泡法（2）生长锥处理法（3）培养基加倍法单倍体育种的意义：1、控制杂种分离缩短育种周期；2、排除显隐性基因干扰，提高选择效率；3、单倍体是诱变育种的良好

20、材料；4、单倍体在远缘杂交中的利用；5、利用单倍体对栽培品种进行纯化第十四章胚培养:采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。 胚相应的发育产物：珠被-种皮，受精极核-初生胚乳核-胚乳，受精卵-胚。从离体胚到完整的植株，其发育途径有3条：1、正常胚胎发育途径 2、脱分化形成愈伤组织 3、早熟萌发产生畸形苗胚乳培养:将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。胚乳培养的类型：1.核型胚乳；2.细胞型胚乳；3.沼生目型胚乳胚乳培养的意义：1、 胚乳培养再生植株证明了全能性理论；