A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免

1、A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免疫应答    【摘要】  目的：构建新发现的A族链球菌（GAS）表面蛋白Fba的真核表达质粒，并将其以及Fba蛋白、M蛋白分别免疫小鼠，对它们诱导的体液免疫及细胞免疫应答进行评价分析。探讨Fba蛋白作为GAS候选疫苗的可能性。方法:以SSI9菌株（GAS M1血清型标准株）作为模板，采用PCR方法扩增Fba基因，测序正确后克隆至真核表达质粒pcDNA3.1，构建真核表达质粒pcDNA3.1/fba；将雌性CD1小鼠随机分成6组，分别为Fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/f

2、ba+Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平；脾细胞增殖试验检细胞增殖水平，并用流式细胞术检测小鼠体内CD4+、CD8+淋巴细胞的变化。试验结果经SPSS10.0统计处理。结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/fba；质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显，其次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示：pcDNA3.1/fba免疫组增殖水平明显高于其它组，流式细胞检测结果与此一致，并显示以CD4+T细胞水平升高为主，CD8

3、+T细胞水平在各组别之间也有一定的差异。结论:（1）Fba蛋白与M蛋白一样均能有效地诱导机体产生抗体，提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。（2）成功构建了Fba蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/fba，且该重组质粒能有效地诱导抗链球菌所需的抗体，并能增强CD4+T 细胞、CD8+ T细胞的增殖功能。 【关键词】1  材料与方法2  结果3  讨论    A族链球菌所引起的感染性疾病及其并发症严重危害人类健康。长久以来认为GAS属胞外菌，但Cleary证实GAS可以侵入细胞，进入细胞的GAS可免受抗生素的攻击及机体免疫系统的破

4、坏7。Cue等8发现，GAS进入细胞是由菌体的表面蛋白介导的。    菌体表面蛋白中对M蛋白的研究最多，但在GAS中M蛋白血清型众多。同时发现M蛋白与人体组织存在着交叉抗原，诱发产生的抗体会与机体组织发生结合，引起变态反应，由此限制了以M蛋白作为侯选疫苗的可能性。Fba蛋白是新发现的表达于A族链球菌的表面蛋白, 属于Fn（Fibronectin，Fn，纤连蛋白）结合蛋白，与金黄色葡萄球菌Fn结合蛋白（FnBPA）有很高的同源性。Fba广泛分布于多种链球菌表面，研究发现GAS的M1，2，4，9，13，22，28，44，49，60，67，75，77，79，80，82，

5、87和89等型别都具有该基因，但不同血清型之间的Fba蛋白同源性很高。Fba蛋白可与补体调节因子H、FHL1结合，这种结合可能有助于GAS抵抗多形核细胞的吞噬，从而影响和支配GAS在体内的毒力、存活、致病性等功能。    实验结果虽然显示Fba蛋白免疫后的Fba抗体水平比M蛋白免疫所诱发的M抗体水平略低，但与其他组比较依然呈现显著的增高，这提示Fba蛋白具有良好的免疫原性；质粒免疫诱导抗体产生的能力明显低于蛋白免疫组，但可以看到pcDNA3.1/fba+Fba蛋白免疫组及pcDNA3.1/fba免疫组所诱导的抗体滴度与pcDNA3.1空质粒比较还是有明显的升高。&

6、#160;   由于抗体不能进入细胞内发挥作用，细胞免疫在对抗胞内细菌的作用上显得尤为重要。CD4+Th1细胞通过分泌IFN、TNF等细胞因子增强巨噬细胞的杀伤活性，从而有利于细胞内细菌的清除；CD8+T细胞又称细胞毒性T淋巴细胞，它通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤和破坏胞内菌感染细胞，使细菌释放出胞外，再经抗体或补体的调理作用由吞噬细胞清除。通过流式技术对各组实验小鼠脾细胞中CD4+、CD8+T细胞的数量及构成比进行分析，结果显示pcDNA3.1/fba组的CD4+、CD8+T细胞所占比例明显高于其他组，同时，脾细胞增殖实验也证实pcDNA3.1/fba组淋巴细胞增殖水平明显高

7、于其他组，表明fba以DNA免疫的方式能够促进CD4+、CD8+T的增殖和分化，增强机体的细胞免疫反应，这种作用将有利于清除侵入细胞内的链球菌，也表明Fba蛋白具有良好的作为侯选疫苗的潜质。当然，Fba蛋白能否能真正作为疫苗蛋白预防GAS的感染，尚有许多深入的研究有待完成，如Fba蛋白或质粒免疫的动物能否抵御GAS的攻击，以及Fba蛋白能否引起变态反应等。尽管如此，本次实验成功构建的真核表达质粒pcDNA3.1/ fba，以及以Fba蛋白或质粒免疫的动物所获得的实验结果依然为今后的进一步研究奠定了基础。【参考文献】  1 Vinod Pandiripally,Lin Wei,Chri

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