中国药典微生物检验规程

1、微生物 检验规 1. 实验注意事项 1.1 无菌操作要求 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 1.1.2 专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用 75酒精棉球将手擦干净。 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使 用，金属用具应高压灭菌或用 95%酒精点燃烧灼三次后使用。 1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及 试管或平皿边。 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操

2、作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞 (即 硅氟胶塞)都要通过火焰消毒。 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 ? 1.2 无菌间使用要求 1.2.1? 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 ? 1.2.2 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于 30min ，使用紫外灯，应注意不得直接在紫 外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿 透的

3、影响。 ? 1.2.3 处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 1.3 消毒灭菌要求 1.3.1 灭菌前准备 (1) 所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 (2) 装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的 2/3 (例如 500mL 的三角瓶最好装 300350mL 培养基，以 防再次加热融化时爆沸)。 ( 3 )无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。 1.3.2 装放 ( 1)干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 ( 2)大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒

4、筒内，物品之间不能过挤。 1.3.3 设备检查 ( 1 )检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 ( 2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度 计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。 ( 3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。 1.3.4 灭菌处理 （1） 干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。灭菌完毕后或温度升温过程中，须在 60 C 以下才能打开箱门。 （2） 立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到零时，自然冷却至 60C后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气 阀

5、，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到 60C以下 再开盖取物，以防突然减压液 体剧烈沸腾或容器爆破。 （3） 物品取出 ,随即检查包装的完整性 , 若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者 ,不可作为无菌物品使用。 培养基或试剂等 ,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态 , 未达到者应废弃。取出的物品掉落在地或误放不 洁处, 或沾有水液 , 均视为受到污染 ,不可作为无菌物品使用。取出的合格灭菌物品 ,应存放于贮藏室或防尘柜 内, 严禁与未灭菌物品混放。凡属合格物品 , 应标有灭菌日期及有效期限。 1.4 有毒有菌污物处理要求 1.4.1 经培养的污染材料及废弃物应放在严密

6、的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭 菌（经微生物污染的培养物，必须经 121 C 30min 高压灭菌）。 1.4.2 染菌后的吸管（即进行阳性菌操作后的） ，使用后放入 5 %煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡 24h （消 毒液体不得低于浸泡的高度）再经 121C30 min 高压灭菌。 1.4.3 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方 可倒入下水道，染色的玻片放入 5%煤酚皂溶液中浸泡 24 h 后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必 须高压灭菌后洗涤。 1.4.4 打碎的培养物，立即用 5%煤酚皂溶液或石炭酸

7、液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。 1.4.5 污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方 能洗涤。 ? 1.5 培养基制备要求 1.5.1 根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸馏水中，在使用前 对应用的试剂药品应进行质量检验。 1.5.2 因高压灭菌可影响一些培养基的 PH 降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的 质量。 1.5.3 盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧瓶）为好。 1.5.4 每批培养基制备好后，应做无菌生长试验（空白平皿试验）及

8、所检菌株生长试验。如果是生化培养基， 使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置 4C冰箱存 放。 2. 实验操作 2.1 准备用具，配制培养基、稀释液、培养箱 ：需氧菌菌总数 胰酪大豆胨琼脂培养基、 霉菌和酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂培养基 控制菌 胰酪大豆胨液体培养基 肠道菌增菌液体培养基 麦康凯液体培养基肠埃希氏菌：丨ml接种至 100 ml麦康凯液体培养基中， 42?44C培养 24?4 8 小时 RV 沙门增菌液体培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 麦康凯琼脂培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 ：0. 9%无菌氯化钠溶液 2.1.4 培养箱：

9、3 个（30?35C、20?25C、42?44C） 2.2 培养基配制 2.3 灭菌 2.4 无菌检查：将灭菌的培养基放入 37C的温室中培养 24 至 48 小时，以检查灭菌是否彻底。 2.5 无菌室准备：用消毒液擦拭无菌室，将本次试验所用的器皿、培养基通过传递窗送到无菌室，样品置于 传递窗，一次性使用物料 （工作服、口罩、手套） 置于缓冲间。开启净化系统 1 小时，关闭净化系统，打开紫 外灯 0.5 小时，关闭紫外灯，至少 0.5 小时后进入无菌室。 2.6 微生物计数检验（平皿倾注法） :一般供试品的检验量为 10g 或 10ml;膜剂为 100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以

10、酌减。检验时， 应从 2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于 4 丸，膜剂还不得少于 4 片。 ： 0. 9% 无菌氯化钠溶液 ： 3 个稀释级（常用 10-1、 10-2、 10-3）（每稀释级每种培养基至少制备 2 个平板） ，同时做空白 （等量稀释剂） 供试液用量为适应性试验确定的，常用 1ml 取培养基，融化并让其冷却至 45C左右，倾入已加入供试液的平皿中，每个平皿约 15mL （即倾倒时液面刚刚 闭合时），在超净台面上轻轻晃动使供试液均匀混合于培养基中，放置一旁待冷却凝固。 2.6.4 培养：待平皿完全冷却凝固，通过传递窗取出，倒置叠放置于培养箱中。培养时间及温度：需

11、氧菌菌总 数 30?35 C培养 3?5 天 霉菌和酵母菌总数 20?25C培养 5?7 天， 2.7 控制菌检验 取供试品 10g，用稀释剂制成 1 : 10 供试液，混匀，在 20?25C培养约 2 小时（可以在无菌室中先做这一步，等 其余试验步骤完成，再继续进行控制菌的下一步 ）。 耐胆盐革兰阴性菌 胰酪大豆胨液体培养基 大肠埃希氏菌 0. 9%无菌氯化钠溶液 沙门菌 直接取样品 10g 或 10ml （增菌培养）：取供试液 10mL （相当于 1g 样品），加在 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确定） 中，30?35C培养 24?48 小时。 耐胆盐革兰阴性菌 肠道菌增菌液体培养基

12、 大肠埃希氏菌 胰酪大豆胨液体培养基 沙门菌 胰酪大豆胨液体培养基 :取相当于 0.1g、0.01g 和 0.001g（或 0.1ml、0.01ml和 0.001tnl）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜 接种平板 肠埃希氏菌：丨ml接种至 100 ml麦康凯液体培养基中， 42?44C培养 24?4 8 小时 体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中， 30?3 5C培养 24?4 8 小时。 沙门菌：0.1 ml接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基中， 30?35C培养 18?2 4 小时。 2.7.4 平板划线分离培养 (1 )培养基平板的准备：取培养基，融化并让其冷

13、却至 50C左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约 15mL,使其 分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。 耐胆盐革兰阴性菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 大肠埃希氏菌 麦康凯琼脂培养基 沙门菌 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 ( 2)各种物品的准备 取出预培养后的控制菌供试液，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、一次性接种针、火柴、酒精棉球、试 管架等。可在阳性菌室或无菌室操作，无菌室准备工作相同。 ( 3)平板划线 以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底 , 拇指和食指打开上盖，使盖与底成 30角，以便划线。 右手握一次性接种针，把接种针上的菌液涂在培养基一侧，一般作 5-8 次划线。将环上的多

14、余细菌材料烧掉 后，从第 1 次划线引出第 2 次划线；再从第 2 次划线引出第 3 次划线，如此反复 3-4 次划线后，即可把整个平 板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的 1-2 次划线上出现多量的单个菌 落，以便进行纯培养。 30?35C培养 18?24 小时。 2.8 培养物的观察 2.8.1 需氧菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。 2.8.2 霉菌和酵母菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。 2.8.3 大肠埃希菌：每天观察菌落的生长情况。 2.8.4 沙门氏菌：菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。如有疑似菌

15、落则用接种针挑选于三 糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 18?2 4 小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。 3. 数据报告 3.1 平皿法：点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数 后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不 小于 15，则两个平板的菌落数不能相差 1 倍或以上。 3.2 控制菌 3.2.1 耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴 性。根据各培养管检查结果，从表 2 查 l g 或 lm l 供试品中含有耐胆盐革兰阴

16、性菌的可能菌数。 3.2.2 大肠埃希菌：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否 为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未 检出大肠埃希菌。 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄 色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌 落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色 (或斜面黄 色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。 3.3 报告规则：需氧菌

17、总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌 落数小于 l00cfu 的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，计算 lg 、lmL 或 10cm2 供试品中所 含的微生物数，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生 长，但平均菌落数小于 1 时，以 1 乘以 最低稀释倍数的值报告菌数。 3.4 结果判断： 101 cfu ：可接受的最大菌数为 20 102cfu ：可接受的最大菌数为 200 103cfu :可接受的最大菌数为 2000，依此类推。 3.5 限度标准： 需氧菌总数 3 10 cfu ( 2

18、000) 102cfu ( 200) 霉菌和酵母菌总数 2 10 cfu ( 200) 1 10 cfu ( 20) 大肠埃希菌 不得检出 沙门菌 （含脏器提取物的） 不得检出 需氧菌总数 4 10 cfu ( 20000) 5X 102cfu ( 1000) 霉菌和酵母菌总数 2 10 cfu ( 200) 102 cfu ( 20) 大肠埃希菌 不得检出 沙门菌 （含脏器提取物的） 不得检出 耐胆盐革兰阴性菌 v 102 需氧菌总数 5 10 cfu ( 200000) 103cfu ( 2000) 霉菌和酵母菌总数 2 5 x 10 cfu ( 1000) 2 10 cfu ( 200) 大肠埃希菌 不得检出 沙门菌（含脏器提取物的）不得检出 耐胆盐革兰阴性菌 v 101 4. 实验时间安排 4.1 第一天:准备用具、培养基、稀释剂，灭菌 4.2 第二天:准备无菌室（预计 2 小时），检验（无菌室操作预计 3 小时），平皿冷却（夏季预计 2 小时，冬 季预计 1 小时），移出无菌室进行培养（预计 0.5 小时） 4.3 第三天:观察培养物（需氧菌菌总数、霉菌和酵母菌总数第一天），耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌