分子生物学实验指导精

1、分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院2008年8月实验一 分子生物学实验技术多媒体演示目的要求通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。教学方式多媒体光盘演示。实验内容基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA目的要求 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同

2、数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。

3、 (3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4与30之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4条件下电泳。 (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更

4、强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。 对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。实验仪器与设备 1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪实验材料 1.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝 5.蔗糖 6.琼脂糖 7.溴化乙锭

5、 8.DNA marker 9.DNA样品实验步骤1.缓冲液的配制 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000mL 5×TBE: Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20mL Ph8.0 凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%溴化乙锭溶液(EB) 0.5g/mL2.制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围 0.3% 5-60 kb 0.6% 1-20 kb 0.7% 0.8-10 kb 0.9% 0.5-7 kb 1.2% 0.4-6 kb

6、 1.5% 0.2-4 kb 2.0% 0.1-3 kb3.胶板的制备 (1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。 (2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1×TBE）。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。 (3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖

7、溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。 (4) 使溶液冷却至60。加入溴化乙锭（用水配制成10mg/mL的贮存液）到终浓度为0.5ug/mL，充分混匀。 (5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。 (6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。 (7)在凝胶完全凝

8、固后（于室温放置30-45分钟） ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。 低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4，并在冷库中电泳。 (8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4加样 DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。每个孔的最大加样量，依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30L样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5电泳 在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,

9、在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动速率不同。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。作业 1 在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。2 采用透射紫外光拍照，照相机镜头加近摄光圈和红色滤光片（580-600n m）,距离50-60cm。采用全色胶卷，5.6光圈,10-20S。（或采用凝胶成像系统，将图片以文件的形式保存） 实验三 DNA的粗提取与鉴定目的要求 学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。实验原理 DNA

10、在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。实验仪器与设备 1. 铁架台 2. 玻璃棒(1个) 3. 滤纸 4. 量筒（100mL，1个） 5. 烧杯(100mL 1个, 50mL和500mL各2个 ) 6. 试管（20mL，2个） 7. 漏斗(1个) 8. 试管夹(2个) 9.

11、 纱布(15块) 10.离心机(1台)实验材料 1. 鸡血细胞液（5mL10mL） 2. 95%乙醇（预冷24h） 3. 蒸馏水 4. 柠檬酸钠(质量浓度0.1g/mL) 5. 氯化钠(2mol/L和0.015mol/L) 6. 二苯胺 7. 高氯酸 8.乙醛 9. 冰乙酸实验步骤 实验前需要制备鸡血溶液，制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液（抗凝剂）100mL，置于500mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实

12、验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液（如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀）。1 提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5mL10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL的烧杯中，取其滤液。2 溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA载溶液中呈溶解状态。3 析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯

13、中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L）。4 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。5 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。6 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。

14、取其滤液，DNA溶于滤液中。7 提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色。8 DNA的鉴定 取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管

15、中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在实验报告册上。作业 1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在实验报告册上。2提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?3. 步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水,两次加入的作用相同吗?为什么?实验四 质粒DNA的制备实验目的 通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒。实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧

16、密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。实验仪器与设备 1.恒温培养箱 2.恒温摇床3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机5.高压灭菌锅 6.超净工作台7.微量移液器 8.eppendorf tub、tip实验材料1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢

17、氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾7.冰乙酸 8.氯仿9.乙醇 10.胰RNA酶11.氨苄青霉素 12.蔗糖13.溴酚蓝 14.酚15.巯基乙醇 16.盐酸17.含pUC18质粒的大肠杆菌 附：试剂的配制1.溶液50mmol/L 葡萄糖5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2.溶液0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合3.溶液5mmol/L 乙酸钾 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL4.TE缓冲液10mmol/L Tris· HC

18、l1 mmol/L EDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100 加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20 。7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚8.酚实验步骤(一) 提取质粒1将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。 2取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。 3吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4将细菌沉淀悬浮于100L溶液中，充分混

19、匀，室温放置10 min。5加200L溶液（新鲜配制），混匀内容物，将离心管放冰上5 min。6加入150L溶液（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。71200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。8向上清中加入等体积酚：氯仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11加50L TE缓冲液，其中含有20g/mL的胰RNA

20、酶，使DNA完全溶解，-20保存。（二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA方法参见实验二作业1. 碱裂解法提取质粒DNA 的原理是什么？2. 用凝胶成像系统拍照质粒DNA电泳图，并分析电泳所得条带实验五 PCR法制备目的DNA实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢断裂而形成两条单链，即变性阶段。2退火：使溶

21、液温度降至50-60，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全，即退火阶段。3延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5´3´方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。典型的RCP反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶

22、。实验仪器与设备 1PCR基因扩增仪 2琼脂糖凝胶电泳系统实验材料1. DNA模板 2. 4种dNTP3. 引物1和引物2 4. Taq酶5. 琼脂糖 6. DNA Marker7. tip 8.eppendorf管9. 微量移液器附试剂的配制： 1. 10×PCR缓冲液 500mmol/L KCl 100mmol/L Tris· HCl (PH8.3，室温) 15mmol/L MgCl2 0.1% 明胶 2. 4×dNTP 10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP3. Taq酶 1u/L4.

23、DNA模板 1ng/L5. 引物溶液浓度 10pmol/L实验步骤1在0.5mL Eppendorf管内配制25L反应体系 反应物 体积/L ddH2O 11 10×PCR缓冲液 2.5 2.5mmol/L dNTP 2.0 25mmol/L MgCl2 1.5 引物1 1.0 引物2 1.0 模板DNA 5 Taq酶 1 混匀,加25L石蜡油.2.按下述程序进行扩增 94预变性 5min 94变性 1min 52退火 30 sec 72延伸 30 sec 重复步骤- 30次 72终延伸 10min 3琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果配制1.5%琼脂糖凝胶，取10L扩增产物电泳。保持电流

24、40mA.电泳结束后，用EB染色15min,紫外灯下观察结果。作业 根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，并讨论PCR反应的注意事项。实验六 限制性内切核酸酶消化反应实验目的 通过本实验学习DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验技术。实验原理1.限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核

25、酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。绝大多数类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5'- GAATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCCGGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'GAATTC3' 5'G AATTC3' ；3

26、'CTTAAG 5' 3'CTTAA G5' 2.DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L

27、NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置于-70低温冰箱内30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 3.DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。构建DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其

28、相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA 加1 单位酶，消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。实验仪器与设备 水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液器，微波炉，紫外透射仪，照相系统实验材料DNA; 重组pUC19 质粒; EcoR I 酶及其酶切缓冲液; Hind 酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)。 附试剂的配制： 1、 5×TBE 电泳缓冲液：见实验二。 2、 6×加样缓冲液：见实验二。3、 溴化乙锭

29、：见实验二。实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管编号，用微量移液枪分别加入1g DNA 和相应的限制性内切酶，10×缓冲液2L，再加入重蒸水使总体积为19L，将管内溶液混匀后加入1L 酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。2. 混匀反应体系后，将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37水浴保温2-3 小时，使酶切反应完全。 3.每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀,以停止反应，置于冰箱中保存备用。4.制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果配制1.5%琼脂糖凝胶，取10L 酶解液与2L 6×加样液混匀电泳。保持电压在60-80V，电流在40mA.电泳结束后，用EB染色20-25min，紫外灯下观察结果。作业 根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，并讨论内切酶酶切反应的注意事项。实验七 E. coli感受态细胞的制备实验七八 DNA连接、转化及重组鉴定实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术实验原理 细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀