川芎药材活性部位的高效液相色谱指纹图谱定性分析方法

1、第24卷第3期2003年6月西安交通大学学报（医学版）（J）H?31&(0I)&1H)&%11)8#3$)%#:)7&(67)#17#$2EVol.24No.3Jun.2003川芎药材活性部位的高效液相色谱指纹图谱定性分析方法王嗣岑，朱丽华，贺浪冲（西安交通大学药学院仪器分析中心，陕西西安7）10061摘要：目的建立川芎药材活性部位的指纹图谱，为其定性鉴别提供依据。方法川芎药材经乙醇超声提取后，用醋酸乙酯萃取，采用O以甲醇水冰醋酸（）为流动相，在2建立DS柱为分析柱，-30:70:0.576nm条件下进行分析，其指纹图谱。并对7种不同来源的川芎药材进行高效液相色谱指纹图谱定性分析比较。结果本研

2、究建立的分析方法的精密度、重现性较好，以阿魏酸峰计，不同川芎药材指纹图谱中主要峰群的RSD分别为1.68%和1.04%；整体图貌基本一致，但各成分含量的相对比值有所不同，不同来源的川芎药材共有峰面积的比值及共有峰面积和均有一定的差异。结论H快速地鉴别区分不同来源的川芎药材。PLC指纹图谱分析法可简便、关键词：川芎；活性部位；指纹图谱；高效液相色谱法中图分类号：R282.5文献标识码：A文章编号：（）1671-8259200303-0221-03HPLC-finerrintanalsisoftheactivepartofgpyRadixLiusticu ChuanxionortgggH，Wani

3、cenZhuLihuaHeLanchongSgg（S，）choolofPharmacXianJiaotonniversitXian710061ChinaygUy：（+）ABSTRACTObecti(e!#$%&()$*&+,-./0)1#33)1%4&%#31,-./5,603%*#&7%)8#4&3%09&:);j24!$%&$()*$+,-.,3%#&7=&3&%)8#$%?:0+,-./5,60$#8#1)1:$09&:);!$%&$(#+#4)et*+,-!)*$+,-.,3%03=:)00#3#1%$?37#$*#$&=(#$A#3#;%3&7%#:A)%*#%*&1(?#3$1)7

4、#+4$4，%#7*1)?#0320=)1&1:#;%3&7%#:A)%*#%*(&7#%&%#!*#CD67(?=1A&$?$#:&$&1&(%)7&(7(?=1%*#B-1（），=)(#4*&$#71$)$%#:0=#%*&1(/A&%#3/&7#%)7&7):30:70:05&1:%*#0(A3&%#A&$1=-=)1A)%*EF.e-/0t-!:#%#7%)1&%2761=*#=#%*:A&$38#1%#4(#7)$#A)%*2:3#3:?7)()%1:%*#96DA&$44&，3168G&1:104G?$)1#3?()7&7):&$%*#$%&1:&3:7=1#1%#$#7%)8#(

5、$&3#&0:)00#3#1%$&=(#$A&$:)00#3#1%42!*)$=#%*:7&1#?$#:%:)00#3#1%)&%#718#1)#1%(1:3&):(&:);!$%&$()*$+,-.,3%03=#+&49:)00#3#1%$?37#$：；KEYWORDS!$%&$()*$+,-.,3%&7%)8#4&3%0)1#33)1%*)*4#303=&17#()?):7*3=&%/#+242B3&*24川芎为伞形科植物川芎（LiusticumChuanx-gg）的干燥根茎，是常用中药之一。中国药ort.iongH典理气定痛、2000年版一部记载其具有活血化淤、12-5养心安神之功效。现

6、代药理学研究表明，6-8选技术并结合离体药理试验，对“四物汤”中各味中药进行拆方分析，发现川芎醇提后的醋酸乙酯萃取部位具有明显的血管扩张作用，是川芎发挥药9效的有效部位。为了控制川芎药材的质量，本实“四物汤”（熟地黄、当归、白芍、川芎）有扩张冠状动脉、降低外周阻力、增加血流量、调节自由基代谢及提高免疫功能等作用，而川芎（RhizomaChuanx-便是“四物汤”中的主药之一。本中心利用细iong）胞膜色谱（，筛cellmembranechromatorahCMC）gpy收稿日期：修回日期：2002-10-082003-01-08基金项目：国家自然科学基金资助项目（N）o.20075020.作者

7、简介：王嗣岑（），男（汉族），在读博士，讲师.1974-验建立了以川芎有效部位为基础的高效液相色谱指纹图谱（H）定性分析方法，并通过对7个PLC-FPS不同商品药店川芎样品的指纹图谱测定，确定了控制川芎药材质量的共有峰和指标峰，为快速、简便地定性鉴别不同来源的川芎药材质量，确保“四物汤”中药的疗效奠定了物质基础。222西安交通大学学报（医学版）第24卷1仪器与试药包括：Shimadzu10AvLC-p高效液相色谱仪，（二极管vvAD10ATSPD-M10Ap溶剂输送泵，pD阵列检测器），SPD-10AvvClass-p型紫外检测器，p及A（日本岛津公司）。色谱纯乙nastar色谱工作站腈和甲醇

8、（美国F；三重蒸馏水（自制）；其isher公司）余试剂均为分析纯；川芎嗪及阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所）；。7份川芎药材样品来源见表1样品由西安交通大学药学院生药教研室鉴定，均为算其余各峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。正品药材（LigusticumChuangxiongHort.），经低温干燥后，粉碎过100目筛成粗粉，备用。表1药材样品来源样品编号来源1陕西藻露堂中药房（藻露堂）2陕西普太和中药店（普太和）3陕西前进大药房（前进）4陕西众康大药店（众康）5陕西省中药材市场（药市）6上海蔡同德堂中药店（蔡同德堂）7北京同仁堂中药店（同仁堂）方法与结果.1分析溶液制备对照品溶液

9、：精密称取川芎嗪及阿魏酸对照品适量加甲醇溶解并定容，制成含川芎嗪及阿魏酸分别为0.42mgmL-1和0.61mgmL-1的对照品储备液，对照品溶液由此稀释得到。供试品溶液：精密称取藻露堂等7种川芎药材粗粉样品各2.0g，置具塞锥形瓶中，加95%（体积分数）乙醇50mL，放置过夜后，超声提取20min，滤过，挥干溶剂后加水20mL溶解，每份样品分别用醋酸乙酯（20，20，10mL）萃取3次，合并萃取液，挥干提取溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，作为川芎醋酸乙酯有效部位的供试品溶液。.2色谱系统适用性色谱条件：色谱柱：Dia-monsilTMODS柱（150mm*4.6mm，5m）；流动相：甲

10、醇-水-冰醋酸（30:70:0.5）；流速：1mLmin-1；检测波长为276nm；室温测定。在此色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10L，注入液相色谱仪，被测组分的色谱图如图1所示，理论塔板数nE5.54（tRW122按川芎嗪及阿魏酸峰计算分别应不低于4500。.3分析方法学考察如图1所示，选择供试品溶液色谱图中的5个色谱峰（15号峰），其中以3号色谱峰（阿魏酸峰）的保留时间和峰面积为基准，计图1对照品溶液（a）和供试品溶液（b）的典型色谱图2川芎嗪；3阿魏酸；15供试品溶液色谱峰表2藻露堂供试品溶液的色谱参数峰号保留时间min相对保留时间min峰面积值相对峰面积值17.470

11、.31436950.57210.910.4546370.06324.461.00768841.00441.061.681041451.35551.052.09126350.16.3.1精密度试验取同一份供试品（藻露堂）溶液，连续进样5次，检测指纹图谱，结果以阿魏酸峰计其保留时间和峰面积的RSD值分别为2.30%、.68%，且各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰比值基本一致。.3.2稳定性取同一份供试品（藻露堂）溶液0L，分别在0、2、4、8、16h注入液相色谱仪，计算其相对保留时间和相对峰面积的RSD值，分别为.65%和2.39%。.3.3重现性取同一份川芎药材（藻

12、露堂）5份制成供试品溶液，检测指纹图谱，结果以阿魏酸峰计其保留时间和峰面积的RSD值分别为1.01%、.04%，且各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰比值基本一致。.4指纹图谱建立.4.1分析方法精密吸取藻露堂、普太和、前进、众康、药市、蔡同德堂和同仁堂的供试品溶液各0L，在上述色谱条件下进样分析，记录其色谱图。计算图谱中各主要色谱峰相对于阿魏酸峰（3号峰）的相对保留时间（Etit3）和相对峰面积值（AREAiA总*100%）。结果见表3，4。22212112122123期王嗣岑，朱丽华，贺浪冲.川芎药材活性部位的高效液相色谱指纹图谱定性分析方法223表37种川芎药

13、材有效部位HPLC图谱主要色谱峰相对保留时间比较样品编号12主要峰相对保留时间（）峰1峰2峰3峰4峰50.3100.4431.0001.6942.1120.3170.4581.0001.6712.076主要峰数553讨论在对流动相组成及检测器波长的选择中，分别以甲醇水（；）和甲醇水冰醋酸-60:4040:6030:70-（进行试验，并记录了2、30:70:0.5）10254269、用甲醇276313nm5个波长的色谱图。结果表明，-30.3100.4551.0001.6232.009540.3050.4491.0001.6682.081550.3080.4511.0001.6192.02156

14、0.3040.4541.0001.6892.107570.3060.4551.0001.6912.10750.3090.45211.6652.072RSD%1.421.101.902.04注：相对保留时间Etit3，ti为各主要色谱峰的保留时间，t3为3号峰的保留时间.表47种川芎药材有效部位HPLC图谱共有峰峰面积比较主要峰绝对峰面积（相对峰面积编号AiAR%）主要峰总峰面积峰1峰2峰3峰4峰5（相对偏差A总%）14369946467687310414212631241996（18.06）（1.92）（31.77）（43.04）（5.22）（-24.35）219787452765855984

15、2416264204836（9.66）（2.21）（32.15）（48.05）（7.94）（-35.97）3273343837396826063815365147037（18.59）（2.61）（27.11）（41.24）（10.45）（-54.04）4316823314486496246112465158570（19.98）（2.08）（30.68）（39.39）（7.86）（-50.43）53521659687571316892626686312479（11.27）（1.91）（24.23）（54.06）（8.54）（-2.31）647809383161104607149102682885

16、186（0.54）（1.06）（18.20）（68.59）（11.60）（176.71）786813809734921538519073289141（3.35）（1.47）（28.36）（59.19）（7.63）（-9.61）-A总E319892注：相对峰面积AREAiA总*100%；主要峰总面积A总Ei；-A总为7个样本的平均总面积；相对偏差%E（A总-AA总）-A总*100%.4.2共有峰确定由表3可见，在7份川芎药材供试品溶液的HPLC图谱中，5个色谱峰的相对保留时间（）均比较稳定，相对偏差小于3%，可以确定为主要峰，其平均相对保留时间为0.304.112；分别计算7个样本主要峰的总面积

17、（A总）、平均总面积（-A总）以及总面积的相对偏差，舍去总面积相对偏差小于-50%的样本（样品编号为3，），最后其余样本（5个）确定川芎有效部位的共有峰为1，2，3，4，5号峰，作为川芎及其有效部位定性分析的指标峰。用此定性指标鉴定7个样本，结果均为川芎药材。水-冰醋酸（30:70:0.5）为流动相，波长为276nm的色谱条件为佳（图1）。在此色谱条件下，通过等度洗脱方式川芎药材的醋酸乙酯有效部位可检出5个主要色谱峰，且保留时间跨度较大，分离效果较好。通过以藻露堂样品为例进行HPLC方法学考察，表明主要色谱峰在HPLC图谱中的稳定性、精密度和重现性均可满足定性分析要求。样品提取方法分别比较了回

18、流提取、超声提取和冷浸超声提取方法，结果表明，冷浸超声提取法的重现性较好。在实验给定的色谱条件下，川芎有效部位的HPLC图谱中可以检出5个色谱峰。通过对7份川芎药材的醋酸乙酯有效部位指纹图谱中包括川芎嗪和阿魏酸在内的5个主要色谱峰相对保留时间（）分析，其RSD均小于3%，表明主要色谱峰的总面积（A总）可以反映有效部位在不同样本中的绝对含量，而各总面积的相对偏差则可以比较有效部位在不同样本中的相对含量。舍去相对含量较小的样本，由其余样本确定共有峰为5个，作为指标峰。本实验所建立的川芎有效部位定性鉴别的指标峰有5个，相对保留时间分别为0.309、0.452、1、1.665、2.072，将其用于7个

19、样本的定性鉴别，结果虽然7个样本中有效部位在含量上差别很大，但均含有5个指标峰，故认为他们是川芎有效部位。如果要确保四物汤的临床疗效，必须建立方中各药材质量控制体系。单味中药材的药用部位较多，成份复杂，加之同一种药材在不同方剂中，发挥药效作用的部位和成份也不尽相同，不可能用一种分析方法对整个药材质量进行全面控制。本文以川芎药材为例，以其在方中与主要药理作用有关的有效部位来建立其质量控制方法，有利于对川芎药材进行综合宏观分析。参考文献：1石力夫，邓延昭，吴百生!川芎干燥根茎挥发油化学成分及其稳定性的研究!药物分析杂志，1995，15（3）：26-30!2陈馥馨!新中成药手册#!北京：中国医药科技

20、出版社，1998!3曹长恩，皮寒义，刘德洪!古方四物汤的现代研究与应用!中成药，1999，21（6）：320-321!（下转第236页）224236西安交通大学学报（医学版）第24卷有的研究表明，移植排斥反应的发生与Th1的激活自身有关，移植物的耐受与Th2状态的维持有关，免疫性疾病表现为T变态反应性疾病表现h1应答，为Th2应答2。身抗体的结果，提示肺炎支原体下呼吸道感染患儿增殖、功能亢进。本研究结B淋巴细胞被过度激活、果中，Th1Th2细胞比例失衡，Th1细胞比例明显升高（P），表现为T0.05h1细胞为主的免疫反应，而Th1细胞是辅助B淋巴细胞产生IA、IM、gg、故推测IG1IG2a等

21、多种免疫球蛋白的重要细胞，gg肺炎支原体下呼吸道感染后B淋巴细胞的过度激活、增殖、功能亢进与Th1细胞的过度辅助有密切关系。本研究结果表明，在肺炎支原体下呼吸道感染患儿多种免疫失衡和紊乱情况中，辅助性T淋巴细胞亚群失衡和B淋巴细胞过度增殖是该病免疫失衡的关键环节。肺炎支原体下呼吸道感染后辅助性主要表现为TT淋巴细胞亚群失衡，h1细胞为主的免疫反应，且B淋巴细胞过度激活、增殖、功能亢进，这两点改变完全符合自身免疫性疾病的免疫病理特点。结合该病临床表现除肺部损伤外，尚多见全身多系统多器官并发症，提示肺炎支原体感染与自身免疫性疾病密切相关。以上结果提示我们，在治疗肺炎支原体感染时，除了抗生素的合理应

22、用外，还应适当加用免疫调节剂，干预自然的免疫进程，减少并发症的产生，缩短病程，改善预后。参考文献：符州!1辅助细胞的免疫应答与哮喘#!国外医学儿科学分册，（）：19982511-3!魏海明，刘杰，田志刚!检测2$1$2亚群的临床意义#!中华医学检验杂志，（）：199821156-58!雷春莲!流式细胞仪检测支原体肺炎及呼吸道合胞病毒肺炎免3疫状态的研究，（）：#!西安医科大学学报，1997184510-512!+黄瑾，李勤，冈田纯!4%&4%&45细胞对()病人*细胞产生自身抗体的调节作用，（）：#!中国免疫学杂志，1998142112对于T目前多数研h1和Th2细胞亚群的探讨，究来源于抗原特异性T细胞克隆和T淋巴细胞分泌的细胞因子测定，但Th1样、Th2样细胞并不局+限于C且T测定D4T细胞，h2细胞因子分泌较少，+困难，对疾病状态下CD4T细胞亚群的变化难于进行准确的判断。细胞表面分化抗原（C是鉴别D）不同细胞克隆的重要膜表面标记，用特异的细胞表面分化抗原来监测T是较为理h1和Th2细胞水平，+想和先进的方法。有研究发现CD4CD45RA+、+、其CD4CD45RO+分别表达于Th1Th2细胞表面，+表达与I、检测CFN-IL-4分别呈正相关3-5，D4+T细胞表面特异性分化抗原CD4CD45RA+，+、CD4CD45RO+能够较好的代表Th1Th2细胞水平。对