七年制学生机能实验设计项目

1、七年制学生机能实验设计项目申 请 书项 目 名 称：心肌缺血再灌注损伤时肝细胞生长因子的产生和临床意义 指导教师：赵赫男年级、班级：七年制05级2班学生姓名：闫丽娜、沈云、刘洋、黄舸联 系 电 话：大连医科大学基础医学院机能实验室 2007年11月一、立题依据及意义：心肌缺血可促进内皮细胞某些致炎基因产物和生物活性物质的表达,某些患者缺血后再灌注,不仅没使组织器官功能恢复,反而使缺血所致的结构破坏进一步加重.缺血再灌注损伤是心脏外科中常见的病理生理过程,目前国内外研究热点,主要集中在心脏的缺血再灌注损伤的预处理保护.目前研究表明,急性心肌梗死有严重内皮细胞损伤及内皮功能失调,可刺激HGF分泌.

2、 HGF能诱导缺血疾病的血管再生,早期HGF能刺激血管内皮细胞的迁移、增生,形成类毛细血管样血管或能修复缺血导致的血管功能不全,保持内皮依赖性冠状动脉血流,对缺血心肌有明显保护作用.最近国外已有报道1,血浆中HGF的浓度在器官损伤时增高,它能诱导缺血疾病的血管再生.本研究旨在通过对大鼠心肌缺血再灌注损伤HGF水平的测定,探讨HGF的表达对治疗缺血再灌注损伤的临床意义-1-二、技术路线：1、动物：SD大鼠20只（体重220 260 g,雄性,18元/只）.2、仪器设备、手术器械：眼科针、小镊子、剪刀、线.3、试剂：HGF扩增的引物序列（由上海生物工程合成公司提供,450元）定量RT-PCR的试剂

3、盒（北京赛百盛基因技术有限公司,25次550元）.4、实验方法： 1、建立缺血再灌注损伤模型.取4周雄性SD大鼠,随机分为对照组和实验组,其中每一大组按不同时间点又分为5个亚组,实验前用苯巴比妥类麻醉.待麻醉后,打开胸腔,于第四肋间隙处,用丝线结扎心脏冠状动脉左前降支,距离其起始端2MM.丝线要系紧,30min后松开2、分别于再灌注后0.5h、1h、2h、3h、5h3、处死动物取左室前壁组织.用定量RT_-PCR方法测定胞浆HGFmRNA的含量. 5、检测指标：心肌细胞胞浆种HGFmRNA的测定：取适量心肌组织按试剂盒说明制成匀浆,用定量RT_-PCR方法测定.（1）采用TRIzol一步法提取

4、心脏组织总RNA,用光度适应计测得光密度（optical density, OD）值进行RNA定量,计算OD260/OD280比值,判定纯度.（2）RT：取制备好的RNA液,加入pd (N)6,70 反应10 min,冰浴5 min,随后依次加入Tris缓冲液、MgCl2 2.4 l、dNTP及ImPromTM逆转录酶,用适量石蜡油覆盖反应液,37 温育90 min,RT产物加灭菌蒸馏水备用.（3）PCR：选用看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH）作为内参照.HGF引物序列：上游引物a) 5'-A

5、GT ATT TCT TCT TTT CAT TCT GAT-3' and 5'-TTA TTT CAT TAT GCA ATA TTT AGG-3' for exon 3; 2 引物扩增产物长度374 bp.G3PDH、HGF的PCR反应参数：预变性94 2 min；94 变性1 min,60 退火45 s,72 延伸45 s,共30个循环；反应结束前72 5 min以充分延伸.（4）HGF扩增产物,在2%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴乙锭）中与G3PDH一起电泳,反射紫外灯下观察并摄影.采用图像分析系统对电泳图像进行光密度扫描,以G3PDH条带作为内参照,计算待测

6、基因的相对表达量（即HGF/G3PDH比值）.-2-三、进度安排：1：建立心肌缺血模型30分钟.2: 缺血灌注6小时.四、预期结果： 组数胞浆内HGFmRNA的含量对照组实验组1组2组3组4组5组Ø 在心肌缺血再灌注损伤时,如果试验组胞浆HGFmRNA含量跟对照组没多大差别,说明HGF对心肌没影响.Ø HGFmRNA浓度较正常对照组明显升高,提示在缺血损伤的心脏组织中,HGF可保护和/或促进血管内皮细胞的修复和血管形成;说明HGF在缺血再灌注损伤中起保护作用实验组在灌注后不同的时间点HGFmRNA的含量先升高再降低,也提示HGF对心肌损伤起保护作用.五、参加课题研究的学生情况姓 名性别外语情况年级班级课题分工本人签 名闫丽娜女05级2班设计、操作沈云女六级05级2班设计、操作刘洋男四级05级2班建模、手术黄舸男四级05级