第3章凯氏定氮法

1、CompanyLOGO第第3章章发酵原料中粗蛋白质的测定发酵原料中粗蛋白质的测定Company L发酵原料中粗蛋白质的测定发酵原料中粗蛋白质的测定v教学重点: 掌握方法的原理、测定步骤；掌握方法的原理、测定步骤； 掌握消化蒸馏、滴定操作技术掌握消化蒸馏、滴定操作技术; ; 学会使用凯氏定氮仪学会使用凯氏定氮仪. .v教学难点: 消化蒸馏、滴定操作技术及消化蒸馏、滴定操作技术及测定过程的注意事项。测定过程的注意事项。 Company L发酵原料中粗蛋白质的测定发酵原料中粗蛋白质的测定v一、目的和意义食物中蛋白质含量是了解人体蛋白质食物中蛋白质含量是了解人体蛋白质摄入量的基础资料。蛋白质含量的高低

2、对摄入量的基础资料。蛋白质含量的高低对产品质量影响重大，是评价原料及成品质产品质量影响重大，是评价原料及成品质量的重要指标之一。量的重要指标之一。Company L发酵原料中粗蛋白质的测定发酵原料中粗蛋白质的测定一类：利用蛋白一类：利用蛋白质的共性即质的共性即含氮含氮量量、肽键和折射、肽键和折射率等测定蛋白质率等测定蛋白质含量；含量；蛋白质的蛋白质的测定方法测定方法另一类：利用蛋白质另一类：利用蛋白质中的氨基酸残基、酸中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质香基团等测定蛋白质含量。含量。Company L5.5.红外检测仪红外检测仪4.4.酚试剂法酚试剂法2.2

3、.双缩脲分光光度比色法双缩脲分光光度比色法1.1.凯氏定氮法凯氏定氮法蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法3.3.染料结合分光光度比色法染料结合分光光度比色法Company L发酵原料中粗蛋白质的测定发酵原料中粗蛋白质的测定v一般食品蛋白质含氮量为一般食品蛋白质含氮量为10左右，动植物原料左右，动植物原料中蛋白质的含氮量一般为中蛋白质的含氮量一般为 15% 17.6%，有的上，有的上下浮动下浮动,可以测出总氮：可以测出总氮：v 蛋白质含量蛋白质含量 = N /16% = N 6.25v肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小，小麦取麦取5.70，大米，大米5

4、.95、乳制品、乳制品6.38、大豆、大豆5.17，动物胶动物胶5.55。含有的元素：含有的元素：C、H、O、NCompany L加碱加碱NaOH蒸蒸馏，使馏，使NH3游游离离样品与浓硫酸样品与浓硫酸和催化剂共热和催化剂共热消化，使蛋白消化，使蛋白质分解有机氮质分解有机氮转化为转化为NHNH3 3，并，并与与H H2 2SOSO4 4结合成结合成（NHNH4 4) )2 2SOSO4 4；再用再用标准盐酸标准盐酸接接s收，过量酸用收，过量酸用标准标准NaOH滴定。或者滴定。或者 用用硼酸硼酸吸收形成硼吸收形成硼酸铵，再以酸铵，再以标准盐标准盐酸酸滴定，根据标准滴定，根据标准盐酸消耗量可计算盐酸

5、消耗量可计算出粗蛋白质的含量出粗蛋白质的含量。常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法消化蒸馏滴定一、原理一、原理Company L（1 1）浓）浓H H2 2S0S04 4使试样中的有机物脱水炭化、氧化。使试样中的有机物脱水炭化、氧化。 浓浓H H2 2S0S04 4在在338338分解产生氧气、破坏有机物，生成分解产生氧气、破坏有机物，生成COCO2 2和和 H H2 2O O2 2。 2H2H2 2S0S04 4 = 2S0= 2S02 2 + 2H + 2H2 2O +OO +O2 2 C +O C +O2 2 = CO = CO2 2 2H 2H2 2 + O + O2 2 = 2H = 2H2

6、 2O O蛋白质蛋白质 RCHRCH（NHNH2 2）COOHCOOH NHNH3 3 +CO+CO2 2 + SO + SO2 2 + H + H2 2O O2 NH3 + H2 NH3 + H2 2S0S04 4 （过量）（过量） （ NHNH4 4）2 2S0S04 4在消化过程中，反应生成的在消化过程中，反应生成的（ NH4NH4）2 2S0S04 4留在溶液中，其他的留在溶液中，其他的产物产物COCO2 2、SOSO2 2及及H H2 2O O都挥发逸出。都挥发逸出。浓H2S04浓H2S04常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法Company L（2 2）CuSOCuSO4 4作为催化剂，加快

7、反应速度。作为催化剂，加快反应速度。 2 CuSO2 CuSO4 4 = Cu = Cu2 2SOSO4 4 + SO + SO2 2 + 2O + 2O 2CuSO 2CuSO4 4 + C = Cu + C = Cu2 2SOSO4 4 + SO + SO2 2 + 2CO + 2CO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 + 2 H + 2 H2 2S0S04 4 = 2 CuSO = 2 CuSO4 4 + 2 H + 2 H2 2O+ SOO+ SO2 2此反应反复循环地进行，反应中产生的新生态氧使有机物此反应反复循环地进行，反应中产生的新生态氧使有机物加快降解。加快降解。（3 3）

8、K K2 2SOSO4 4使反应液沸点提高，可达使反应液沸点提高，可达400400。 K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4 = 2KHSO = 2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4 = K = K2 2SOSO4 4 + SO + SO3 3 + H + H2 2O O（4 4）H H2 2O O2 2可加速有机物分解。可加速有机物分解。 H H2 2O O2 2 + 2H + 2H+ + = 2H = 2H2 2O EO E0 0=1.77V=1.77V O O2 2 + 4H+ 4H+ + = 2H = 2H2 2O EO E0 0=10299V=10299V常

9、量凯氏定氮法常量凯氏定氮法Company L（5）30% NaOH溶液使消化液中的溶液使消化液中的NHNH3 3通过蒸馏游通过蒸馏游离出来。离出来。 （ NHNH4 4）S0S04 4 + 2NaOH =Na + 2NaOH =Na2 2SOSO4 4 +2H +2H2 2O + O + 2NH2NH3 3蒸馏出来的蒸馏出来的NHNH3 3被被H H3 3BOBO3 3吸收：吸收： 2NH2NH3 3 + 4 H + 4 H3 3BOBO3 3 = = （NHNH4 4）B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O O(6)(6)生成的（生成的（NHNH4 4）B B4 4O O7 7

10、用用HClHCl滴定：滴定：（NHNH4 4）B B4 4O O7 7 + 2 + 2 HClHCl + 5H + 5H2 2O = O = 2 NH2 NH4 4ClCl + 4 H + 4 H3 3BOBO3 3试样中的总氮（粗蛋白）试样中的总氮（粗蛋白）= =蛋白质中的氮蛋白质中的氮+ +氨基酸、氨基酸、酰胺、核酸等中的氮酰胺、核酸等中的氮常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法Company L二、试剂与器材二、试剂与器材1、消化液：、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：12、粉末硫酸钾粉末硫酸钾硫酸铜混合物硫酸铜混合物 K2S04与与CuS04.5H20以以 3：1混合混合3、30氢

11、氧化钠溶液氢氧化钠溶液4、2硼酸溶液硼酸溶液 5、标准盐酸溶液、标准盐酸溶液(约约0.01 molL)6、混合指示剂混合指示剂(田氏指示剂田氏指示剂) 由由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。很窄且灵敏。7、待测样品、待测样品Company L三、操作方法三、操作方法滴定接收蒸馏蒸馏消化消化Company L三、操作方法三、操作方法1. 消化前样品处理消化前样品处理 固体样品固体样品105烘干至恒重。烘干至

12、恒重。 若样品为液体若样品为液体(如血清等如血清等)，可取，可取一定体积样品直接消化测定。一定体积样品直接消化测定。？Company L2、消化消化v 取凯氏烧瓶取凯氏烧瓶 标号。各加标号。各加几几颗玻璃珠颗玻璃珠;1及及2号瓶中各加样品号瓶中各加样品0.1g，催化剂催化剂200 mg，消化液消化液5 mL。3及及4号瓶中各加号瓶中各加相同量的催化剂和消化液相同量的催化剂和消化液-对照，对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。质。 1、加样时应直接送人瓶底，不要沾在加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。瓶口和瓶颈上。2、火力控制，先小后大。、火力控制，先

13、小后大。3、消化完全。、消化完全。注意事项注意事项Company L（2）蒸馏 3、蒸馏吸收、蒸馏吸收Company L 3、蒸馏吸收、蒸馏吸收v 特点：将蒸汽发生器、蒸特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，体，体积小，安装容易，操作简便。操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室水蒸汽发生器和反应室2)冷凝器和通气室冷凝器和通气室3)排水柱排水柱v 关键：搞清水管系统关键：搞清水管系统Company L3、蒸馏吸收、蒸馏吸收1、消化液加蒸馏水稀释后, 应及时蒸馏, 2、蒸馏时，加入氢氧化钠要过量，溶液应呈褐色,若是呈蓝色,则说明碱不够. 并且动作还

14、要迅速以防止氨的流失3、蒸气发生瓶内的水装至三分之二体积并且保持酸性以防止在碱性条件水中游离氨蒸出, 使结果偏大。4、蒸馏时蒸气要发生均匀,充足, 蒸馏中不得停火断气, 否则会发生倒吸。5、停止蒸馏时防止倒吸, 应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口, 再蒸1min 后关掉热源。6、蒸馏是否完全, 可用精密pH 试纸测冷凝管口的冷凝液来测定,中性则说明已蒸馏完全。注意事项注意事项Company L4 4、滴定、滴定v全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色由绿变淡紫色为滴定终点。为滴定终

15、点。v使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林。使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林。滴滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！及时记录读数定时一边滴一边摇，防止滴定过头！及时记录读数v要求：空白液要求：空白液1次，样品消化液次，样品消化液2次次注意事项注意事项Company L5 5、计算、计算v 总氮量总氮量 () = =c c为标准盐酸溶液摩尔浓度为标准盐酸溶液摩尔浓度( (0.00980.0098M)M)；V V1 1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mLmL数；数；V V2 2为滴定空白液用去的盐酸溶液为滴定空白液用去的盐酸溶液mLmL数；数；w w为样品重量为样品重量( (1 1g)g)。1414为氮的相对量子质量。为氮的相对量子质量。 消化液总量消化液总量500500ml, ml, 蒸馏时消化液用量蒸馏时消化液用量3 3ml ml 样品蛋白质含量样品蛋白质