注射用头孢曲松钠中抗氧剂测定方法的建立

1、注射用头孢曲松钠中抗氧剂测定方法的建立    【摘要】  目的 建立测定注射用头孢曲松钠中抗氧剂2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚(BHT)的HPLC方法。方法 Alltima C18色谱柱(4.6mm×250mm，5m)，以乙腈水(7723)为流动相，检测波长208nm，流速1.0ml/min，柱温为室温。结果 色谱图中抗氧剂BHT与其他成分的分离度及其检出灵敏度完全满足检测要求，最小检出量为1.3ng。结论 本法简便、专属、能有效控制产品的质量。 【关键词】  抗氧剂； 头孢曲松钠； 高效液相色谱法  &

2、#160; ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC method for determination of butylated hydroxytoluene (BHT) in ceftriaxone sodium for injection.  Methods  BHT and other related substances in ceftriaxone sodium were separated by a mobile phase consisted of acetonitrilewater (7723, V/

3、V) at a flow rate of 1.0ml/min on an Alltima C18 column and detected at 208 nm.  Results  The resolution and sensitivity of BHT were acceptable. The detection limit was 1.3 ng.  Conclusions  This method simple and specific to be used for the quality control of ceftriaxone soeium

4、for injection.    KEY WORDS  Antioxidant;  Ceftriaxone sodium;  HPLC    头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)是由瑞士Roche公司在20世纪80年代推出的第三代头孢菌素。贮存过程中，注射用头孢曲松钠溶液易变混浊以至澄清度不符合中国药典的规定。在2000年全国注射用头孢曲松钠监督抽验中共抽查126个批次，22批不合格，其中溶液澄清度不合格的有16批，占不合格样品总数的73%1。近年来的研究发现，胶塞与头孢曲松钠的相容性是导

5、致注射用头孢曲松钠贮存过程中溶液澄清度变混浊的主要原因，已有关于药用丁基胶塞与头孢曲松钠相容性的研究2。但是，受药品本身稳定性、药品流通贮存环境等因素的影响，胶塞与头孢曲松钠的配伍相容性难题上一直没有实质性的突破，也尚未见何种物质导致注射用头孢曲松钠贮存过程中溶液变混浊的详细报道。我们最近的研究发现，药用丁基胶塞的成分之一抗氧剂2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚(BHT)可以在注射用头孢曲松钠样品中被检出，并在实验中发现抗氧剂BHT是影响头孢曲松钠的溶液澄清度的物质之一3。BHT本身是一种酚类抗氧剂，能抑制或减缓高分子材料自动氧化反应速度的物质，主要用于橡胶、塑料等加工工业，也作为油脂抗氧剂使用。

6、近年来，国外不少学者研究发现，BHT对肺、肝等组织有直接损害作用，并有促进肿瘤发生的可能4，5，故建立注射用头孢曲松钠中抗氧剂BHT含量的测定方法，对控制产品的质量非常必要。    本文旨在建立一种测定注射用头孢曲松钠样品中抗氧剂BHT含量的HPLC方法，为进一步研究丁基胶塞与药物的相容性奠定了基础，国内外未见报道。    1  仪器与试药    Waters 2690 HPLC系统(Waters 996 Photodiode Array Detector)；BHT从Sigma公司购买。注射用头

7、孢曲松钠的样品来源：样品1：注射用头孢曲松钠(批号04072614)由山东瑞阳制药有限公司提供；样品2：注射用头孢曲松钠(批号020228)由珠海联邦制药厂有限公司提供；样品3：注射用头孢曲松钠(批号000124)由中外合资通化茂祥制药有限公司提供；样品4：注射用头孢曲松钠(批号000301)由重庆药友制药有限公司提供；样品5：注射用头孢曲松钠(批号000303)由昆明积大制药有限公司提供；样品6：注射用头孢曲松钠(批号20000402)由中日合资哈尔滨博利尔药业有限公司提供。乙腈为色谱纯试剂，丙酮为国产分析纯，水为高纯水。    2  方法 

8、   2.1  样品溶液的配制    取整瓶样品(标示量1.0g/瓶)置20ml顶空瓶中，加入10ml丙酮，用超声波超声5min，配制成100mg/ml的头孢曲松钠混悬液，静置后，取上清液用有机滤膜过滤后，取20l滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。    2.2  色谱条件    色谱柱：Alltima C18(4.6mm×250mm，5m)；流动相：乙腈水(7723)；流速1.0ml/min；柱温为室温，检测波长208nm；样品浓度100mg/ml；进样体

9、积20l。    3  结果与讨论    3.1  方法学考察    (1)线性考察  精密称取BHT 10.8mg，置于50ml容量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置50ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为4.32g/ml的溶液。依次吸取0.5、1.0、2.5和5.0ml至10ml的容量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，分别配制成浓度为0.216、0.432、1.08和2.16g/ml的溶液，分别取各溶液20l注入液相色谱仪，记录色谱图。百事通&

10、#160;   以进样浓度对峰面积回归，得回归方程：    A=157.56C+1.2733  r2=0.9999    说明BHT在0.2164.32g/ml的浓度范围内，峰面积与进样浓度呈良好的线性。    (2)精密度考察  取浓度为1.4g/ml的BHT的对照品溶液重复进样5针，主峰峰面积的RSD为0.58%，可见方法的精密度良好。    (3)最低检出限和最低定量限考察  以信噪比为31计算最低检出限为0.4ng；以

11、信噪比101计算最低定量限为1.3ng。    (4)溶液的稳定性考察  取含量测定项下的样品溶液，将溶液在室温条件下放置0、4、8和24h后，分别进样20l，记录色谱图，计算主峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)为1.05%，说明溶液在24h内保持稳定，可保证检测结果的准确性。    (5)回收率考察  注射用头孢曲松钠样品(批号020228，由珠海联邦制药厂有限公司提供)中没有能够检出抗氧剂BHT，所以将此批样品作为空白样品，进行加样回收率考察。    取整瓶注射用头孢曲松钠样品，分

12、别加入浓度为6.68g/ml的BHT对照溶液0.5、2.0和5.0ml，每个体积各两份，然后分别加9.5、8.0和5.0ml丙酮，用超声波超声5min，充分摇匀，使成混悬液。静置后取上清液，用有机滤膜过滤，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算回收率(图1和表1)。    3.2  样品测定结果    样品溶液的配制方法同2.1，每批样品取5瓶同时测定。    从测定的结果可以看出，所测定的6批样品中有两批样品没有检测到抗氧剂BHT，其它4批样品均检出了一定量的抗氧剂BHT，但是不同批次的样

13、品之间所含抗氧剂BHT的差别比较明显(表2)。表2  不同批次样品中所含抗氧剂BHT的含量测定结果    3.3  讨论    (1)溶解样品的溶剂选择  头孢曲松钠本身能溶于水，抗氧剂BHT则不溶于水。所以测定样品中的抗氧剂BHT应选择有机溶剂溶解样品，使样品中的抗氧剂BHT充分溶解；而头孢曲松钠不溶解，减少了头孢曲松钠对样品中抗氧剂BHT测定的干扰。    选择乙醇和丙酮两种有机溶剂进行考察。取整瓶样品(每瓶1.0g)置20ml顶空瓶中，分别加入10ml无水乙醇和丙酮，用

14、超声波超声5min，配制成100mg/ml的头孢曲松钠混悬液，静置后取上清液用有机滤膜过滤后，取20l续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。发现用两种有机溶剂溶解样品，所得到的抗氧剂的峰面积没有明显差异，但用无水乙醇溶解样品的色谱图中，头孢曲松钠的色谱峰比较明显，而且由于配制的浓度比较大，造成色谱柱超载，对色谱柱有一定的损害；在采用丙酮溶解样品的色谱图中，基本没有出现头孢曲松钠的色谱峰，最终选择丙酮作为溶解样品的有机溶剂。    (2)检测波长的选择  从抗氧剂BHT的紫外吸收光谱图中可以看出(图略)，抗氧剂BHT在200400nm的波长范围内存在两个吸收峰

15、，分别在208和276nm处。由于注射用头孢曲松钠样品中所含有的抗氧剂BHT的量均比较少，为达到较高的检测灵敏度，我们选择208nm作为抗氧剂BHT的检测波长。    (3)色谱条件的选择  有些样品溶液的色谱图中(图略)抗氧剂BHT前有一相邻杂质峰，与抗氧剂BHT较难分离。在用乙腈水(7921)作为流动相时，抗氧剂BHT与相邻杂质则不能很好分离；改用乙腈水(7723)作为流动相时，两者可以很好分离。    (4)样品测定的均匀度  在测定样品的过程中，每批样品均取5瓶样品进行测定，结果显示，除了一批样品所含的抗氧

16、剂BHT的量较高，5份样品测定结果的RSD小于2.0%外，其它三批样品的RSD均较大，在10.0%左右。除了样品中所含有的抗氧剂BHT比较微量的原因外，主要是因为样品中的抗氧剂BHT均来自药品包装所用的药用丁基胶塞，不同的样品与胶塞的接触时间、面积都在贮存过程中存在一定的不同，同时每瓶样品所用的丁基胶塞也存在一定的差异，对样品的测定结果也会带来一定的影响。    (5)GC-FID法测定的问题  曾利用GC-FID的色谱条件测定注射用头孢曲松钠中含有的抗氧剂BHT，方法是将注射用头孢曲松钠样品配制成100mg/ml的水溶液，顶空条件为80顶空30min。

17、但实验过程中发现存在如下主要问题：对照溶液的配制。由于抗氧剂BHT对照试剂本身不溶于水，所以无法用水配制对照溶液。实验中，曾尝试先用丙酮配制一定浓度的对照溶液，然后取少量对照溶液置20ml顶空瓶中，将丙酮在室温条件下挥发，然后加2ml水，将顶空瓶密封后顶空加热进样，但重现性不好；灵敏度较差。测定的最低检出限在微克水平，由于样品中含有的抗氧剂BHT相对比较少，所以方法的灵敏度不好，直接影响样品中抗氧剂BHT的检出。【参考文献】  1 涂林，余方键，胡昌勤. 国产注射用头孢曲松钠的质量现状J. 中国药事，2002，16(1)：4546.2 肖全英，雪芳，曾环想，等. 注射用头孢曲松钠的胶塞相容性研究J. 广东药学院学报，2004，20(6)：610611.3 Zhao X, Jin S H, Hu C Q. The effect of rubber closures on the haze state of ceftriaxone sodium for injection J. Drug Dev Ind Pharm,2007,33(1):3544.4 Kehrer J P. Bleomycin and cyclopho