表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立

1、表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立         08-03-01 15:34:00     编辑：studa20                   作者：王雅丹，胡豫，张璐，黄靖，孙春艳【摘要】  过去的研究证实脑源性神经营养因子（BDNF）在体外具有促进多发性骨髓

2、瘤（MM）细胞增殖并诱导MM血管新生的能力。本研究探讨BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点，并比较两种途径建立人MM NOD/SCID小鼠模型的优缺点，为深入探索治疗MM的新靶点奠定基础。选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通过皮下注射或尾静脉注射人骨髓瘤细胞株RPMI8226建立两种异体移植动物模型。观察荷瘤后小鼠的生长状态，测量皮下瘤块的体积；荷瘤后3周，每周经眼眶后静脉丛采血，检测血清中人源轻链含量、Ca2+浓度和血浆中人源BDNF浓度，并计数红细胞；小鼠死后，采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征，流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性CD38细胞比例，采用

3、计算机X线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。结果表明：皮下注射模型的成瘤率高（5/5），具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征，但其骨髓中未检测到MM细胞，血清中钙离子浓度不高，M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低（4/7），骨髓中可检测到呈浸润生长的人CD38细胞；而且在荷瘤3周后，血清中即可检测到人源M蛋白；随着肿瘤的生长，M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高，并有溶骨性损害的影像学证据。两种模型血浆中人源BDNF的水平亦逐渐升高，9周时浓度分别为（73±11）pg/ml和（105±18）pg/ml。结论：本研究成

4、功建立了两种高表达BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型，两种模型相互结合应用，为探索MM治疗的新靶点BDNF/TrkB提供了合适的动物模型。 【关键词】  多发性骨髓瘤     Establishment of Multiple Myeloma Mouse Models Expressing Brain Derived Neurotrophic Factor        Abstract    Previous studies have

5、demonstrated the effects of brainderived neurotrophic factor (BDNF) on promoting proliferation of multiple myeloma (MM) cells and inducing angiogenesis in MM in vitro. This study was aimed to  further explore whether BDNF/TrkB pathway is a potential therapeutic target in MM, and to elucidate

6、60; the   advantages and disadvantages  of  two ways   developed  for  human myeloma xenograft in animal models.   The models of xenograft tumors were established in the nonobese diabetic /severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice by subcutane

7、ous  or intravenous  injection of human myeloma cell line RPMI8226. Mice were monitored daily for life state,  and the volume of subcutaneous tumors were measured after inoculation. 3 weeks after inoculation, red  blood cell counts, BDNF level in plasma, human light chain &#

8、160; and calcium level in serum of NOD/SCID were detected every two weeks. The histological and cytological examinations were performed to observe pathological  features of tumors. Using flow cytometry to observe the expression of human CD38+ cell in murine blood and bone marrow. The changes of

9、 bone density and skeletal lesions were detected by computer radiography.  The  results showed that the subcutaneously injected animal model showed a  high  growth efficiency of RPMI8226 subcutaneous tumors (5/5) and  several pathological features of plasmacytomas. There wer

10、e neither  obvious increase in light chain  and  calcium levels, nor spread of human MM cells to murine bone marrow and no radiological evidence of skeletal lesions. The intravenously injected animal model had relative   low efficiency for growth of tumors (4/7) but MM cells

11、 could engraft  and proliferate in murine bone marrow. The human light chain could be  detected in serum as early as 3 weeks after inoculation. Myelomabearing mice had high level of light chain and  high calcium   in serum and resorption of the murine bone.  Furthermore

12、, the concentrations of BDNF were increased with the tumor growth in both models with （73±11）pg/ml and（105±18）pg/ml in plasma respectively at  9 weeks   after inoculation.  It is concluded that   two appropriate MM xenograft NOD/SCID animal models were establi

13、shed, both of which show high BDNF levels in the plasma. Therefore,  two valuable in vivo systems to explore novel therapeutic target (BDNF/TrkB)  in MM  have been set up successfully.    Key words    multiple myeloma; animal model; brain derived neurotro

14、phic factor    J Exp Hematol 2007; 15(5):967-972    表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立    我们的研究已经证实，脑源性神经营养因子（BDNF）与其高亲合力的受体TrkB结合后，具有诱导多发性骨髓瘤（MM）血管新生的能力并可以在体外诱导MM细胞增殖、迁移1-5。为了进一步探索BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点、拮抗BDNF/TrkB能否阻碍疾病的发展，需要建立一种合适的MM动物模型。虽然我们已经建立了一种基质胶MM细胞裸鼠模

15、型，但在荷瘤前需给予裸鼠射线照射以便抑制B细胞和自然杀伤（NK）细胞的免疫活性, 并且缺少对该肿瘤组织学特征的描述。    糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠是免疫缺陷小鼠品系中残留免疫较少的品系之一，它缺乏功能性的T/B细胞和循环补体，并且NK细胞和巨噬细胞功能也存在缺陷6，因此常被作为许多正常和恶性人源细胞的移植载体，包括MM细胞株和MM原代细胞7,8。国内有关MM动物模型的报道较少，多为皮下种植模型9。国外学者虽然应用NOD/SCID小鼠建立的MM模型较为成熟，但并未涉及BDNF的表达。    在本研究中，我们

16、将高表达BDNF的人MM细胞株RPMI8226通过两种途径种植于NOD/SCID小鼠以建立MM动物模型，比较两种模型的优缺点，并检测其体内BDNF的表达情况，为深入探索BDNF/TrkB途径在MM中的作用奠定基础。    材料和方法    试剂    兔抗人BDNF抗体和兔抗人CD38抗体购于Santa Cruz 生物技术公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和FITC标记的羊抗兔IgG为Pierce公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD38或PerCP标记的小鼠抗人CD45单克隆抗体为Becton Dic

17、kinson公司产品。淋巴细胞分离液、RPMI 1640培养液购于Gibco公司。BDNF ELISA试剂盒购于R&D公司。    细胞培养    人类MM细胞系RPMI 8226细胞购于中国医学科学院基础医学研究所，置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37、5CO2及饱和湿度的培养箱中培养。取经台盼蓝染色鉴定细胞存活率大于95 %并处于对数生长期的细胞进行实验。    NOD /SCID小鼠的饲养    4-6周龄NOD /SCID雄性小鼠20只，

18、购自上海斯莱克实验动物研究所，饲养于SPF级实验室中。饲料经60Co照射，饮用水及垫料均经高压消毒无菌处理。对小鼠的所有操作均在无菌层流条件下进行。    模型的建立    取6-8周龄NOD /SCID 鼠，接受300 cGy 射线照射(放射源60Co 剂量率172 cGy)，照射后24小时内将3×107个RPMI 8226细胞悬于200 l PBS溶液中，并经过尾静脉注射途径输注于NOD /SCID小鼠体内（7只），以同体积的PBS溶液作阴性对照（4只）；或不经过照射，左后肢皮下注射2×107个RPMI8226细胞（5只），同部位注射PBS溶液作阴性对照（4只）。每日监测小鼠的体重、皮毛、活动情况、有无麻痹瘫痪症状和感染迹象等。经皮下注射的小鼠还需测量皮下瘤块的体积（ab2/6，a为长径，b为短径）。待小鼠自然死亡，生存时间以种植瘤细胞当天至死亡时的天数计算。    血液学指标的测定    荷瘤3周后，每周经眼眶后静脉丛采血350 l ，单周时不加抗凝剂，4 000 r/min离心5分钟，取血清于 -20储存备用，采用比浊法检测血清中人源轻链的含