表观遗传学第七章siRNA与miRNA介导的调控

1、表观遗传学 第七章 siRNA与miRNA介导的调控 Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrTransfer RNA (tRNA)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrRibosomal RNA (rRNA)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCNature Biotechnology21, 1441 -1446 (2003)r一、RNA干扰及其机制r二、MicroRNAs在发育中的调

2、控作用r三、RNAi与异染色质r四、miRNA在癌症发生中的作用r五、siRNA的应用Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCmRNA水平上诱导具有特异性序列的基因沉默的过程r2. 转录后沉默：Post-transcriptional gene silencing, PTGSEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNA干扰：生物体内通过双链RNA分子在nEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 1990年，Rich Jorgensen将由强启动子控制的Chal

3、conesynthasegene转入淡紫色的矮牵牛花-加深紫色r2. Hypopigmentation: 许多花出现杂色，甚至紫色消失，变成白色r3. Co-suppressionr1. 1995年，Su Guoand Kenneth J. Kemphues，线虫r2. 利用反义RNA技术阻断线虫中的par-1基因。在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强。效地抑制基因的表达！r3. 然而，正义RNA和反义RNA都能够有r4. 沉默的效应能够在被注射的动物及其后代中保持，虽然RNA转录本在胚胎早期就发生降解Epigenetics, 2008-2009, Semester 1,

4、USTC生物w秀w-w专.b心bioo做.c生om物Control dsRNAEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCds-gfpRNAYoung larva (幼虫)Adult (成虫)adult body wall at high magnification (高放大倍数的成虫体壁)No hybridization and staining+antisense+hybridizationadult body wall at high magnification (高放大倍数的成虫体壁)Epigenetics, 2008-2009, Semester

5、1, USTC生物w秀w-w专.b心bioo做.c生om物+ hybridization (endogenous mex-3RNA)+dsmex-3RNA+hybridizationEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2. 外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 植物细胞可以通过降解病毒RNA 的方式来对抗病毒的入侵，称为转录后沉默(PTGS)r1. 从双链RNA产生的小干扰RNA可以用不同机制关闭基因的细胞机器r2. 为什么外源的dsRNA

6、能够抑制与其序列同源的基因的表达？Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrA. Postinitiationmechanisms. miRNA物通过阻碍翻译的延伸，或者促使核糖体与mRNA生分离来抑制mRNA的翻译rB. Cotranslationalprotein degradation. 做m在多肽链翻译后的同时使其降解心oc.专o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrD. Argonaute招募eIF6，从而阻止大的核糖体亚基与小亚基的结合Epigenetics, 2008-2009,

7、 Semester 1, USTCrC. Argonaute与eIF4E竞争结合capEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrE. Argonaute通过脱腺苷化(deadenylation) 阻止loop mRNA的形成rF. MicroRNA-mediated mRNA decay. miRNA触发脱腺苷化并使得底物mRNA decapping域的核糖核酸酶，将dsRNA切割成小的short interfering RNAs(siRNAs) or microRNAs(miRNA)，并将这些产物加载到RISC上r2. RISC (RNA induce

8、d silencing complexes) (RNA诱导的沉默复合体): 包含多个蛋白质的复合物，将与之连接的siRNA或miRNA定位到其靶点并抑制靶基因的表达Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC生物w秀w-w专.b心bioo做.c生om物r1. Dicer: RNaseIII类似的，包含多个功能结构r序列的结构组成:物生r1. 一个PAZ结构域，与做mdsRNA的末端结合心o贾第鞭毛虫c.专or2. 两个RNaseIII结构-oi秀bb生能结构域wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenet

9、ics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. PAZ 结构域与两个具有催化活性的RNaseIII结构域分离r2.PAZ结构域与RNaseIII结构域的距离为65 angstrom，与25个bp的RNA长度一致r3. Dicer是一个分子尺，负责识别dsRNA并在特异位点切断Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC的核心成员2. AGO蛋白质一般包含PAZ和PIWI两种功能结构域3. PAZ与双链siRNA3-端露出的两个核苷酸结合4. PIWI负责将双链siRNA切成单链5.PAZ和PIWI对于SiRNA与底物mRNA之间的相互

10、作用是必须的，并负责底物的断裂或转录抑制6. 不同的AGO具有不同功能，例如人类AGO2负责的RISCs能够割裂底物mRNA，而AGO1和AGO3则不能Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrrrrr生物w秀w-w专.b心bioo做.c生om物r1. Argonaute(AGO): 大的蛋白质家族，为RISCs物生做m心oc.专o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC物生做m心oc.专o-oi秀bbEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. dsRN

11、A首先需要被Dicer相关的复合物进行处理，然后在Argonaute相关的复合物的引导下发挥功能；r2. Dicer和Argonaute家族的成员在RNA诱导的沉默通路中发挥功能，不同的组成通过不同的机制引起沉默r3. 例如，不同的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. MicroRNA(miRNA): 一种非编码小的RNA (2123 bp)，通过Dicer剪切其前体RNA (70-90 )所得r2. miRNA以RNA-蛋白质复合物的形式，在动物和植物的细胞中广泛

12、的表达，也称为miRISCsr3. 在发育的过程中起着关键性的作用，能够促使与miRNA序列同源的靶基因的mRNA的降解或者翻译的抑制r(A) pri-miRNAs的结构r(B) 人类pri-miR-30a RNA 的发夹环；Drosha切割位点(箭头)，Dicer切割位点(三角)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Pri-miRNA被Drosha切割r2. pre-miRNA被Dicer切割r3. Exportin5 (Exp5) 将miRNA装运到胞质中Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2.

13、 Drosha和Dicer都具有RNaseIII 和dsRNA结合结构域Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RIII, RNaseIII 催化结构域; D, dsRNA结合结构域; PRORICH, proline-rich结构域; RS-RICH, arginine/serine rich结构域r1. miRNAs发现的数量近年来快速增长r2. 2006年10月，miRBase9.0，收录4361个具有发夹结构的前体miRNAs，能够表达出4167个miRNA产物r3. Release 12.0，收录8619个具有发夹结构的前体miRNAs

14、，能够表达出8273个miRNA产物Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. miRNAs: 通常21-25bp的非编码RNA，从大的前体RNA中剪切所得，形成的茎环结构。成熟的miRNA一般从前体RNA的发夹环的一个柄上，由RNaseIII剪切所得；至少在动物中，绝大多数的miRNAs与底物的3UTR区域结合，抑制其翻译Epigenetics, 2008-2009, Semester 1,

15、 USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. miRNAs和siRNAs都需要Dicer以及RISCs的处理，从而引起转录后抑制r2. siRNAs和miRNAs的分子特性相似，功能也相似r1. lin-4 和let-7 miRNAs调控线虫发育的时间点Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr在线虫的幼虫发育期，lin-4下调LIN-14和LIN-28蛋白质的浓度，从而一方面阻止后期发育，一方面促进幼虫的发育Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigene

16、tics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Forward genetics: lin-4 & let-7 r2.Reverse genetics: miR-181, mir-273Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Asymmetric chemosensory neurons：ASE left (ASEL) and ASE right (ASER), 感受环境的化学刺激r2. ASEL表达gcy-7, ASER表达gcy-5，化学

17、受体Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 在Zebrafish, Medaka, Mouse, 和Fly中表达miR-124a和miR-1 r2. miR-124a仅在鱼和鼠的脑以及脊髓中表达，在果蝇的腹神经索中表达r3. miR-1仅在小鼠的肌肉和心脏中表达r4. miR-124a和miR-1的序列保守性高小鼠果蝇Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrjaw-D的突变对TCP基因表达的影响r1. 3种miRNA控制造血干

18、细胞向淋巴物细胞的分化过程：miR-181，miR-223，miR-142sr2. miR-181: 主要在小鼠骨髓的生做B-淋巴m细胞中表达r3. miR-223: 骨髓原细胞心oc.专o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 降低细胞毒素T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocytes) 识别裂解的能力r2. 病毒早期转录肿瘤抗原(Tantigen)r3. 在

19、转录后期，SV miRNAs结合早期的肿瘤抗原，并使之降解r4. 降低肿瘤抗原的浓度，从而降低细胞毒素T淋巴细胞识别的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Adenovirus virus-associated 1 (VA1) RNA. r2. 在核里与其它前体miRNA竞争与exportin-5的结合，竞争与Dicer的切割r3. 干扰免疫应答Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 宿主miR-32与primate

20、foamy virus type 1 结合限制其扩增，病毒的Tas能够抑制该过程r2. 肝特异性的miR-122能够与HCV结合，使其扩增，可能是激活病毒的复制，或者改变其亚定位Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNAi调控异染色质的沉默与组蛋白H3K9的甲基化;r2. 在fission yeast中删除argonaute, dicer等基因，破坏RNAi机制，发现动点附近的异染色质重复片段表达异常的转录本r3. 由H3K9的甲基化缺失导致转录激活，损伤动点的功能r4. 动粒的重复片段，其转录沉默的状态由H3K9的甲基化以及染色质与Swi6

21、结合所决定。和维持是必须的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNAi的分子机器对动粒重复片段的异染色质化的起始r1. 动粒反链的转录片段被物RNAi沉默并降解生r2.动粒正链转录本低表达，被做m心oc.Rdp1扩增并产生siRNA专or3. Rdp1与染色质结合-oi秀，促进bb生组蛋白w修饰wEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 重复片段相关的siRNA(rasiRNA) 通路：r2. 重复片段的双链的相对的启动子转录，形成长链dsRNAr3. 由Dicer切割成siRNAsr4. 与RI

22、SC结合，引起同源DNA的沉默Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. dsRNA与染色质沉默密切相关r2. 植物的转基因被同源dsRNA的表达所沉默，并使同源DNA区域发生甲基化r3. 由siRNA介导，甲基转移酶能够被招募到靶基因的位点Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 人中已发现695个miRNAs，命名为：has-miRxr2. miRNA在癌症发生中表达谱的变化: 检测334个哺乳动物样本中的217个miRNAs的表达情况r3. 与正常组织相比，miRNAs在肿瘤中的表达显著的下调r4.

23、 与mRNA相比，miRNA的表达谱是一个很好的癌症分类指标Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrGastrointestinal tract (GI): 胃肠道r1. c-Myc调控的miRNA控制E2F1的表达r2. c-Myc是一个具有helixloophelix的亮氨酸拉链的转录因子，调控人类和果蝇基因组中约1015%的基因的表达r3. c-Myc激活人类13#染色体上成簇的六个miR

24、NAsr4. E2F1是一个转录因子，在c-Myc的下游，促使细胞周期的发生Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Tet: tetracycline (四环素)，降低c-Myc的表达r2. -/-: c-Myc敲除r3. -/-(Myc): c-Myc敲除后再转入外源c-Myc基因Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. +/+: 野生型Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2

25、. 在DNA损伤以及癌基因压力的情况下，通过依赖于p53的通路中诱导r3. 在肿瘤及其分化的细胞株中过表达miR-34能够抑制细胞周期的过程Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. p53调控miR-34ac的表达Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. SA-Gal：检测衰老的细胞G1SG2/MEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC增，与正常细胞相比，其表达量明显上调r2. mir

26、-1792的基因簇与c-myc协同作用，促进小鼠中B细胞淋巴瘤的生长Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. mir-1792的基因簇在人类B细胞淋巴瘤中扩Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 46个淋巴瘤样本和47个直肠癌的样本vs. 正常组织r2. mir-1792基因簇表达明显的上调Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. siRNA一般2123bp: 19bp的双链互

27、补区，两边对称的、伸出的序列，5-phosphate (P) and 3-hydroxyl (OH) 基团.r2. 正义siRNA的5端稳定性较高，3端稳定性较低，切割位点稳定性也较低r1. mRNA的ATG下游50-100bp，最好75bp r2. 效率较高的siRNA设计模体: AAN19TT, NAN19NN, NARN17YNN, NANN17YNNr3. 50%GC含量(30-70%)r4. 尽量避免三个连续相同的核苷酸，尤其是GGGr5. 避免序列上已知是mRNA结合蛋白质位点的部分Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC|化学合成: 较贵r2. 使用T7启动子体外转录前体miRNA|体外表达的dsRNA能够被大肠杆菌的RNaseIII或RNaseIII-like DICER所切割Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 将外源的siRNA转入细胞中(暂时的表达)物生做m心oEpigenetics,