毛细管电泳电化学发光检测技术及其在生命科学中的应用

1、毛细管电泳电化学发光检测技术及其在生命科学中的应用汪尔康，刘继锋，曹卫东，严吉林，杨秀荣中国科学院长春应用化学研究所，电分析化学国家重点实验室，长春 130022周起设西安瑞迈电子科技有限公司，西安，710054摘 要 为适应生命科学对高精度分离分析方法的要求，发展高选择性、高灵敏度的检测技术用于毛细管电泳 (CE) 一直是分析科学的研究热点。近年来，我们实验室对于CE 三联吡啶钌 Ru(bpy)32+ 电化学发光 (ECL)，即 CE-ECL 方法进行了系统研究，研制成 ECL 仪、CE-ECL 仪，发展了 ECL 试剂固定化检测及 ECL 试剂衍化检测等技术，并应用于临床药物分析。本文对

2、CE-ECL 的检测原理、仪器装置、新型检测池、CE-ECL 最新发展、在药物和临床分析等方面的应用予以介绍，并对 CE-ECL 在生命科学中的基因与蛋白质分析、重大疾病标识物的筛选与检测、临床诊断的应用及其微全分析等领域进行展望。关键词 毛细管电泳 电化学发光 生化分析一、引言基因组学、蛋白质组学、药物基因学以及糖组学是生命科学的研究热点。生命科学研究急待解决的关键问题包括：人类疾病相关基因和蛋白质的识别、鉴定和克隆、疾病相关基因和蛋白质的结构与功能研究、与疾病防治相关的基因和蛋白质表达的调控等，以实现对人类重大疾病预警和早期诊断、研制出治疗包括癌症和艾滋病等在内的多种疾病的药物的研究目标。

3、生命科学的发展将越来越依赖先进的分析技术和仪器，例如，阵列毛细管激光诱导荧光技术是促使人类基因组测序计划提前完成的决定因素。当前，世界各国投入巨资开展的后基因组研究，所使用的分析方法远不能满足高通量、快速分析的要求，要建立数据完整可靠的各种文库尚需开发更快速、更方便、更准确的基因、蛋白分析技术和工具，这是对分析化学的挑战。CE因其分离速度快、效率高、样品用量小等特点而成为近20年分离科学领域发展迅速的分离技术。CE在生物大分子的分离分析中应用较多，尤其是DNA分析1-3，用于小分子，例如药物分子的分析也是CE应用的一个重要方面，有关的研究报道和综述很多。例如用于药物-蛋白结合4、药物代谢动力学

4、5、临床和法医研究等6。CE分析中应用较普遍的检测方法有紫外可见光谱，其次是荧光、激光诱导荧光以及质谱方法。荧光、激光诱导荧光以及质谱方法具有较高的检测灵敏度，但是荧光或激光诱导荧光检测往往需要进行化学衍生，质谱检测所需的仪器设备较昂贵。近10多年来，电化学检测，尤其是安培检测因其灵敏、成本低、易集成等特点使其在CE药物分析方面得到了应用7,8。我们实验室一直致力于新型电化学检测方法的研究与应用，我们希望检测技术除了灵敏，还需要具有结构简单、操作方便、更好的选择性等特点。我们曾将CE安培检测应用于药物分析9-12，近期又将电化学检测器集成到CE芯片上，这些研究将有助于电化学检测应用于CE检测技

5、术。三联吡啶钌Ru(bpy)32+ 电化学发光 (ECL)方法目前主要应用于高效液相色谱 (HPLC) 和流动注射 (FIA) 中草酸盐、氨基酸、肽、有机胺、抗生素等物质的分析，此外免疫分析和DNA探针分析是Ru(bpy)32+ ECL技术最有商业价值的应用领域。IGEN公司的蛋白质和核酸Ru(bpy)32+衍生标记试剂及其相关仪器已经在临床疾病诊断 (例如HIV病毒检测)、DNA序列测定、PCR反转录定量分析信使RNA等分子生物学领域中应用。近几年，Ru(bpy)32+ ECL技术逐渐应用于CE，简称CE-ECL13-21，检测一些含氮的小分子物质。CE-ECL存在一些技术难点，例如，如何设

6、计毛细管与工作电极的界面，以提高分离效率；毛细管电泳的进样量很小，因此对检测灵敏度提出了很高的要求；如何对ECL非活性的物质进行分离检测等。ECL可应用于生命科学领域，可以预言CE-ECL方法也必将在该领域中显示其快速、高效、灵敏、经济等优点。我们已装置ECL仪、CE-ECL仪，并应用于含氮药物的分析，在动物实验的基础上又进一步将这种技术应用于临床分析，检测了病人体液中的药物含量，实验证明CE-ECL技术对于药物临床分析具有很好的应用价值。我们正进行CE-ECL在药物代谢动力学、药物与蛋白质作用等方面的研究，及用于生物大分子分析。本文力求在介绍前期研究成果和研究思想的基础上，对CE-ECL技术

7、在未来的人类蛋白质组计划以及重大疾病的预警与早期诊断，以及生命科学的其它研究领域展望。二、研究成果（一）CE-ECL检测原理分离出的被测物与工作电极表面电化学氧化产生的Ru(bpy)33+在电极的扩散层区域发生均相ECL反应，产生的光子作为电泳峰记录下来。被测物 (例如有机胺) 也会接触电极表面发生电化学氧化，产生的自由基与Ru(bpy)32+反应，但是该途径对ECL反应的贡献就CE-ECL体系而言可以忽略，因为检测池的毛细管与工作电极界面区域的Ru(bpy)32+与被测物的相对浓度较大。显然，CE-ECL采用的是离柱检测的方式，从毛细管中泳出的部分被测物在未到达电极之前由于扩散或对流作用而进

8、入检测池中，不能接触到Ru(bpy)33+进行ECL反应。这种现象类似于电化学安培检测中遇到的库仑效率的问题。影响发光强度和分离效率的因素主要有发光反应的量子效率和反应速率，较慢的反应动力学导致较差的分离效率，这是CE-ECL的一个特点。而决定量子效率和反应速率的因素有溶液的pH值、反应物的浓度、反应物的分子结构 (即ECL活性)、以及电泳分离高压、进样量、电极材料和尺寸等。（二）主要研究工作1. CE分离与Ru(bpy)32+ ECL检测系统的结合 Ru(bpy)32+溶液可以添加到电泳缓冲液中，但Ru(bpy)32+会吸附在毛细管壁上，分析性能差。Ru(bpy)32+柱后加入可以采用两种方

9、式：Ru(bpy)32+溶液用泵输送至毛细管和工作电极界面处，毛细管中流出的被测物与Ru(bpy)32+一起到达工作电极，发生原位ECL反应16,19,21；Ru(bpy)32+添加到毛细管末端的发光试剂贮池中。在前一种方式中存在装置复杂的问题；在后一种方式中，由于溶液蒸发和毛细管内流出液体的稀释作用会影响Ru(bpy)32+的浓度，因此发光试剂贮池中的溶液需要定时更换，但装置简单，所以应用较多14,15,17,18。总体而言，在已经报道的CE-ECL工作中目前尚缺少结构明确、可将分离毛细管和检测器方便安装在一起的电化学发光检测池，在已报道的工作中，一般将毛细管，电极，发光试剂贮池安装在各自独

10、立的部件上14，使用内径大于或等于75 m的毛细管，并且为避免电泳电流对电化学检测信号的干扰，需要在毛细管上制作裂缝，使电泳电流接地。上述系统均存在分离检测装置复杂，操作十分繁琐，检测灵敏度低的问题。我们设计制作了一种柱端Ru(bpy)32+ ECL检测池22，分离毛细管的内径25m，盘状工作电极的直径300m，工作电极周围是三维调节螺丝，因此使得毛细管与电极之间准直调节非常简单，而且准直状态可以长时间保持，因此分析结果的重现性大大提高。我们还详细考察了电泳高压对Ru(bpy)32+氧化电位的偏移影响、毛细管内径、毛细管与电极最佳间距等参数，发现适当的间距条件下，即使内径较大的毛细管 (50

11、or 75 m) 也可以不需要制作接地裂缝而直接使用，获得理想的分析结果23。2. CE 与 FIA 通用型微型化ECL流通检测池我们设计了一种CE与FIA通用的ECL分析仪器。实现这一技术的关键是设计一种通用性的ECL流通池。CE 的进样量很小(nL 级)，因此不能采用传统的HPLC与FIA体系中使用的由薄层安培检测池改装的ECL流通池。我们设计了一种CE与FIA通用的ECL流通池24，其主要的特点是通过更换CE分离毛细管和FIA进样管，从而切换工作模式。CE工作模式下，Ru(bpy)32+溶液通过两个移液枪头 (分别位于流动体系液流方向的上下游，作为Ru(bpy)32+溶液的贮池和废液池)

12、 之间液面高度差形成的静压力驱动，流经毛细管与工作电极界面。Ru(bpy)32+溶液的流速通过安装在贮池底部的毛细管(作为限流器)直径大小控制，体积流量 (100L/h)，因此检测区域的发光试剂在实验过程中一直保持新鲜和固定的浓度，消除了柱端检测方式中可能存在的溶液蒸发或者毛细管液流稀释作用带来的误差，提高了分析结果的重现性。用于FIA时，将用作Ru(bpy)32+溶液贮池的移液枪头用橡胶垫密封，用作废液池的移液枪头安装FIA出口导管，进行FIA实验。该ECL流通检测池的灵敏度和重现性优于已经报道的其它类型的CE-ECL检测池，与报道的FIA-ECL流通检测池的性能相当。3. CE固态ECL检

13、测器Ru(bpy)32+固定在电极表面制作成的ECL检测器可简化仪器装置、减少试剂。另外通过控制电极电势可对CL反应进行时间控制，对于反应速度快的反应，由于发光发生在电极表面，可进行空间控制，因此需要制作性能优良的Ru(bpy)32+固定化的ECL检测器。我们将Ru(bpy)32+固定在聚苯乙烯磺酸溶胶凝胶聚乙烯醇接枝共聚物构成的膜中，采用旋涂的方法制备用于毛细管电泳的固态电化学发光检测器25。以三丙胺和脯氨酸作为研究对象表征了毛细管电泳固态电化学发光检测系统的特征，考察了氧化电位、膜内Ru(bpy)32+含量、溶液pH等对检测灵敏度的影响。加入聚乙烯醇接枝共聚物增强了膜的机械强度和柔韧性，使

14、该膜能在溶液中稳定保存而不发生变化，从而提高了分析结果的重现性。另外，我们还将Ru(bpy)32+固定在ITO电极上，制作成廉价的、可抛弃的ECL检测器，有望用于临床药物分析。 利用微乳化方法合成纳米尺寸的包含Ru(bpy)32+的SiO2颗粒，Ru(bpy)32+在其中以团聚的颗粒形态存在，通过考察电化学电流的稳定性，我们发现与常规溶胶-凝胶方法固定的Ru(bpy)32+相比不易流失，同时还保留了一定的电化学活性。我们将这种SiO2颗粒用聚苯乙烯滴涂在ITO或玻碳电极上，制作成新型的Ru(bpy)32+固定化ECL检测器26。4. CE-ECL在临床药物和癌症标识物分析中的应用利用这种新型技

15、术分析了麻醉和止痛药物利多卡因、普鲁卡因和抗生素林可霉素、降血压药物利血平27、抗组胺药物本海拉明28、帕金森和痴呆症治疗药物普环啶29和本海索等多种药物，检测限界于 10-9-10-8 mol/L 之间, 线性范围大于 3 个数量级。我们首次将这种技术应用于临床样品分析，建立了利多卡因、曲马多和舒比利药物的分离分析方法，分析了手术后病人尿中的利多卡因和曲马多30，以及精神病人血浆和尿中的舒比利22。结果说明毛细管电泳电化学发光检测技术所具有的快速、高灵敏度和良好的选择性可以满足临床分析的要求，因此这种方法具有良好的药物代谢和临床分析应用价值。多胺类物质一般指比较常见的腐胺Put; NH2(C

16、H)4NH2, 尸胺Cad; NH2(CH)5NH2, 精胺Spd; NH2(CH)3NH(CH)4NH2 和精脒Spm; NH2(CH)3NH(CH)4NH(CH)3NH2四种物质，它们是真核细胞和原核细胞中的成分，在生物体的代谢过程中起着非常重要的作用。多胺参与 DNA 的复制、基因表达、蛋白合成，影响细胞表面受体功能等机理已经被广泛研究31,32。另外，生物体内多胺含量与肿瘤的生长状态之间的关系一直是分析科学、临床医学等领域研究的热点课题，抑制肿瘤患者体内多胺的生物合成是治疗癌症的一个主要途径33,34。我们研究了 CE-ECL 技术在多胺分析中的应用35，系统考察了溶液浓度、酸度、电极

17、材料、不同电势的激发方式等对灵敏度和分离精度的影响，建立了多胺分析的 CE-ECL 实验参数。实验证明，CE-ECL 可以满足对人体内多胺含量的分析。5. Ru(bpy)32+衍生物标记蛋白的 ECL 检测在免疫和 DNA 探针分析中经常需要用 Ru(bpy)32+ 衍生物对待测分子衍生，使其具有 ECL 活性，通常的做法是在磁微球表面上进行免疫反应或杂交，之后进行自动筛选，高通量分析。Ru(bpy)32+ 衍生物作为生物分析中的标记物具有无毒、无放射性、稳定性好，可以进行多重 ECL 反应，放出多个光子，因此具有较高的灵敏度。即使是多重标记的蛋白质（如抗体） ，其生物活性也可以长期保持，因为

18、 Ru(bpy)32+ 衍生物相对于蛋白质分子而言是小分子，因此对蛋白质的活性影响很小。免疫和 DNA 探针分析中所需的酸度条件与 Ru(bpy)32+衍生物 ECL 反应所需的酸度条件相近，生物基底中的杂质对反应影响较小。所以 ECL 检测技术在免疫和 DNA 探针分析，以及 PCR 产物分析中得到较广泛的应用。我们实验室合成了几种 Ru(bpy)32+衍生物，对蛋白质进行标记后，CE 分离，利用 Ru(bpy)32+/三丙胺反应体系检测，目前已经得到一些初步结果。该方法有望应用于癌症标识物的筛选和检测，具有很好的临床应用研究价值。另外，我们正研究微型阵列 ECL 检测芯片，利用微机电加工技

19、术制作出带有阵列微型腔体的芯片，硅烷化处理，固定 Ru(bpy)32+ 衍生物标记的抗体或单链 DNA，进行免疫反应或杂交，施加电位，进行 ECL 检测。该工作有望进一步提高疾病诊断、肿瘤标识物筛选和检测的速度，在分子生物学和临床医学研究领域将颇有应用前景。6. 微流芯片 ECL 检测技术当前，CE 芯片是应用最多的微型化分离器件，电渗流驱动模式可以省略微型泵、阀等器件，简化仪器装置。我们设计了玻璃、聚合物 CE 芯片，并研究了不同的 ECL检测器集成到芯片上的方法，其中以 ITO 导电玻璃作为芯片底片，加工出工作电极，或者采用无电沉积和毛细管微模化技术制作检测器，设计了新型、微型化的 CE-

20、ECL分析系统36。三、CE-ECL 技术展望CE 作为一种生化分离技术已经得到较广泛的研究和应用，可以预见将对蛋白质组学研究起很大的促进作用；ECL 方法在免疫和 DNA 探针分析中的应用说明 ECL 方法是生物分析领域中很可靠的检测技术。我们将两种分析技术结合，发挥其高效率分离，高灵敏度检测的优点，满足实际分析的需求。我们已设计研制成 ECL 仪和 CE-ECL 仪，并预期可以批量生产，这是发展 ECL 和 CE-ECL 的基础。我们将进一步发展这种技术，结合分子生物学、临床医学、药物学等领域的相关研究，将其应用于临床诊断，重大疾病标识物的筛选与检测。生命科学的发展当前正呈现一个与应用研究

21、和产业开发越来越紧密的态势，许多研究成果可直接变为具有高利润的商业数据库，基因或蛋白质的信息已成为各大药物公司追求的目标。而 CE-ECL 仪器和分析技术将迎合这种发展趋势，成为推动生命科学发展的力量，带来巨大的社会和经济利益。致 谢 感谢国家自然科学基金委员会的支持参 考 文 献1 Krylov S N, Dovichi N J. Anal. Chem., 2000, 72:111R-128R.2 Hu S, Dovichi N J. Anal. Chem., 2002,74: 2833-2850.3 Dolnk V, Hutterer K M. Electrophoresis, 2001;

22、22: 41634178.4 Oravcov J, Bhs B, Lindner W. J. Chromatogr. B, 1996,677:1-28. 5 Sung W-C, Chen S-H. Electrophoresis, 2001, 22: 42444248. 6 Thormann W, Lurie I S, McCord B. Marti U, Cenni B, Malik N. Electrophoresis, 2001,22: 42164243. 7 Wang A, Fang Y. Electrophoresis, 2000,21:1281-1290.8 Kinssenger

23、P T. J. Pharm. Biomed. Anal., 1996, 14:871-880.9 You T, Yang X, Wang E. Electroanalysis, 1999,11:459-464.10 Liu J, Yang X, Wang E. Chin. J. Anal. Chem., 2002, 30:748-753. 11 Sun X, Cao W, Bai X, Yang X, Wang E. Anal. Chim. Acta, 2001, 442:121-128. 12 Sun X, Gao C, Cao W, Yang X, Wang E. J. Chromatog

24、r. A, 2002, 962: 117-125. 13 Forbes G A, Nieman T A, Sweedler J V. Anal. Chim. Acta, 1997,347:289-293.14 Dickson J A, Ferris M M, Milofsky R E. J. High Resol. Chromatogr., 1997,20:643-646.15 Bobbitt D R, Jackson W A, Hendrickson H P. Talanta, 1998,46:565-572.16 Wang X, Bobbitt D R. Anal. Chim. Acta,

25、 1999,383:213-220.17 Chiang M-T, Whang C-W. J. Chromatogr. A, 2001, 934: 59-66. 18 Hendrickson H P, Anderson P, Wang X, Pittman Z, Bobbitt D R. Microchem. J., 2000,65:189-195. 19 Wang X, Bobbitt D R. Talanta, 2000,53:337-345. 20 Arora A, Eijkel J C T, Morf W E, Manz A. Anal. Chem., 2001,73:3282-3288

26、.21 Huang X-J, Wang S-L, Fang Z-L. Anal. Chim. Acta, 2002,456:167-175.22 Liu J, Cao W, Qiu H, Sun X, Yang X, Wang E. Clin. Chem., 2002,48:1049-1058.23 Cao W. Liu J, Yang X, Wang E. Electrophoresis, 2002, 21:3683-3691.24 Liu J, Yan J, Yang X, Wang E. Anal. Chem., in press.25 Cao W, Jia J, Yang X, Dong S, Wang E. Electrophoresis, 2002,21:3692-3698.26 Liu J, Jiang X, Kang J, Yang X, Dong S, Wang E. To be submitte