RNA干扰技术及其应用

1、1RNA干扰的发现及发展早在1995年,Guo等1利用反义技术研究线虫的基因功能时,发现靶向Par21的反义RNA可以阻遏该基因的表达,但正义链的导入亦可出现类似现象,据此推测正义RNA可能同反义RNA一样能有效抑制互补序列基因的表达,并提出了RNAi现象的概念,但当时并未取得十分令人信服的解释。1996年,Rich Jorgensen及其同事在研究矮牵牛时发现一个奇怪的现象:他们将一个能产生色素的基因置于一个强启动子之后,导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没有看到期望中的深紫色花朵,而大多数花朵却变成了花斑色甚至白色。因为导入的基因和与其相似的内源基因同时被抑制,当时将这种现象命名为协

2、同抑制(cosuppression。1998年Fire等2在研究秀丽新小杆线虫基因组计划时,发现这种抑制并不是单独正义链的作用,而是正义链中污染了反义链后形成的双链RNA 所致。他们称此基因沉默现象为RAN干扰(RNAi,即双链RNA在mRNA水平关闭互补序列基因的表达。随后此技术在全球得以广泛的开展和应用,并在其它动物如果蝇、锥虫、涡虫等中相继证实。随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组学研究领域中的有力工具,RNAi也越来越为人们所重视。如今RNAi在发育生物学、基因调控、基因功能的研究以及肿瘤和病毒的基因治疗等方RNA干扰技术及其应用李建霞1,2,苗向阳1

3、,任惠英1,2,丁兆忠1,于忠娜1,2(1中国农业科学院畜牧研究所,北京100094;2莱阳农学院,山东城阳266109摘要:RNA干扰(RNA interference,RNAi即通过双链RNA的介导特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默的现象。作为一种简单有效的影响基因表达的工具,RNA干扰已经被广泛应用于许多领域,同时也为基因功能的研究开辟了一条新途径。文章综述了RNA干扰的机制及其应用方面的最新进展。关键词:RNA干扰;双链RNA;基因功能;应用中图分类号:Q522文献标识码:ARNA Interefence Techenology and ApplicationL

4、i Jianxia12,Miao Xiangyang1,Ren Huiying1,2,Ding Zhaozhong1,Yu Zhongnuo12(1Institute of animal sciences,Chinese academy of agriculture sciences,Beijing100094;2Department of animal science and techonolegy,laiyang agriculture college.chengyang shandong266109 Abstract:RNA interference is a post-transcri

5、ptional gene silencing mechanism that dsRNA specifically suppresses the expression of a gene in many aspects.As a technically simp le and an effective genetic tool which can exert effect on the expression of gene in some degree,and RNAi provides a new way in the study of gene function activity.The m

6、echanisms of RNA interefence and recent advance in study on appli-cation are outlined in this paper.Key words:RNA interefence,dsRNA,Gene function,Application基金项目:国家自然科学基金资助项目“猪早期胚胎发育相关基因的研究”(30571339、国家自然科学基金资助项目“猪脂肪细胞膜基因工程抗体的研究”(30070543、国家高技术研究发展计划(863计划资助项目“鸡输卵管生物反应器及转基因禽蛋表达系统的研究”(2001AA213131、中国

7、农业科学院创新基金项目“转基因猪新技术研究”(2004-院-1。第一作者简介:李建霞,女,1981年出生,山东安丘人,硕士研究生,主要研究方向:动物病毒学。通信地址:100094北京海淀圆明园西路2号中国农业科学院畜牧兽医研究所。Tel:010-*;E-mail:lijianxia_2004。通讯作者:苗向阳,男,1968年出生,山东莱州人,副研究员,博士,主要从事基因工程与功能基因组学研究。Tel:010-*;E-mail:mxy32收稿日期:2006-07-11,修回日期:2006-09-27。面发挥了重要作用。2参与RNA干扰的分子参与RNA干扰的分子包括dsRNA,siRNA, Dic

8、er,RISC,RdRP。dsRNA可以是外源的,如病毒复制的中间体或人工导入的dsRNA,也可以是内源的,如细胞中的单链RNA在RNA聚合酶(RPRD的作用下形成的dsRNA。dsRNA产生后被核糖核酸酶类(如Dicer处理加工成2123nt的“guide RNA”,这些引导RNA也被称为细小干扰RNA(siRNA。Dicer是一种ATP依赖性核酸内切酶,Dicer家族在进化上非常保守,有5个组成部分,即N端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域,2个RNase结构域和C端dsRNA 结合基序。RISC实际上是介导mRNA序列特异性裂解的核酸内切酶复合物,是由siRNA中的反义链指导形成的一种

9、核蛋白体,该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RISC3。RdRP是一种RNA依赖的RNA 聚合酶(RdRPs,它以siRNA为引物,以靶mRNA为模板,将靶RNA通过聚合酶链式反应(PCR转变为双链RNA。3RNA干扰的简要作用机制RNA干扰机制的最初成果来源于Hammilton A 等在果蝇S2培养细胞成功建立了可重复性的RNA 干扰实验,发现并分离提取了RISC。RNA干扰过程至少包括两个阶段4:起始阶段和效应阶段。也有学者认为有大致3个阶段,即其中还包括有siRNA扩增阶段。3.1起始阶段在起始阶段,进入细胞的dsRNA被具有RNase类核酸酶“Dicer”切割,形成2123个核苷酸

10、的dsRNA。此阶段还需要Rde21、Rde24等共同参与。Rde21、24编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合,然后Dicer将dsRNA解旋,由于Dicer的活性形式为二聚体,且仅有两个催化结构域行使功能,因而可将dsRNA切割为2125nt大小的片断,称为细小干扰RNA(siRNA。3.2效应阶段由Dicer产生的siRNA仍然与Dicer结合,通过细胞内其它蛋白质的参与形成RNA介导的RISC。在图1RNAi作用机制ATP作用下,Dicer解旋酶区域指导siRNA解旋,其反义链特异性地与细胞中具有同源序列的mRNA配对,内切核酸酶在mRNA分子间与siRNA互补的区域进行切割

11、,只不过切割部位大约与siRNA相错10个碱基5。切割后的mRNA由于没有5帽结构和Poly(A尾巴的保护,很快被其它的核酸酶降解。3.3siRNA扩增阶段RNAi具有高效性,少量的双链RNA即可引起同源基因的沉默,导致明显的基因敲除表型,合理的解释是在整个RNAi过程中存在起始信号不断扩大的机制。siRNA特异性的与mRNA结合,siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA,新的dsRNA又被RNaseE!样的Dicer内切酶切割产生次级siRNA,次级siRNA 又可以进入下一轮循环。4RNAi的应用4.1RNAi在基因组功能研究中的应用人类

12、基因组图谱及其初步分析结果的报道6,以及多种模式生物、重要生物基因组全序列的完成7,标志着结构基因组学的研究已取得了重大进展。基因功能的研究将成为基因组计划完成后又一重大课题,目前基因功能研究方法主要有基因转导、反义技术、转基因基因剔除、染色体转导、RNA干涉等。与传统的研究基因功能的方法如基因剔除、基因诱变技术相比,RNA干涉技术具有很多优点,例如RNA干涉具有很高的特异性,只特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。即使发生一个碱基的错配,RNAi作用的效应也会大大降低8;RNA干涉抑制基因表达的效率很高,细胞仅需几个分子的小干扰RNA(small interference RNA,

13、siRNA,即可产生类似于缺失突变体表型的RNAi效应;RNA干涉抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持。正因为RNA干涉技术具有上述特征及优点,在功能基因组学研究中的应用越来越广泛。Wianny等与Svoboda等分别在小鼠胚胎与卵母细胞中完成了RNA干扰实验。Elbashir等将人工合成的21nt dsRNA 导入人胚胎肾细胞中,产生了特异的RNA干扰,表明dsRNA在哺乳动物中能诱导产生特异的基因沉默。4.2RNAi转基因动物研究通过转基因技术研究RNAi转基因动物,从而在全身组织细胞中抑制靶基因表达是RNAi技术的一个重要应用。其中应用最广的是小鼠转基因模型。

14、RubinsonDA等9用表达shRNA的重组慢病毒分别感染小鼠胚胎干细胞和受精卵,制备了CD8、CD25和P53的RNAi转基因小鼠。基因敲除小鼠模型。从动物整体水平研究基因的功能,具有很多其他技术手段无法比拟的优点。然而基因敲除小鼠模型的建立周期长、技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。与基因敲除小鼠相比,RNAi转基因小鼠无论在时间上还是步骤上,都有着很大的优势。对于RNAi 转基因小鼠来说,更方便的是可以同时进行两个或多个RNAi载体的共注射,产生双抑制或多抑制的效果10,加快了获得突变的转基因动物的进程。

15、另外,基因敲除能够达到的效果是100%的把靶基因敲除。一些疾病可能是因为体内某种或某些蛋白表达的水平不同导致的。这样,利用基因敲除就无法实现这类疾病模型的建立。而基因敲低在理论上可以实现从1%到99%的抑制效果,弥补了基因敲除的缺陷。现有的研究资料证实,RNAi技术不仅可以在整体水平上实现瞬时的RNAi效应,而且可以在转基因动物体内实现长期地、稳定的RNAi效应。4.3RNAi用于病毒感染的预防及治疗自首次报道RNAi以来,RNAi技术由于其特有的优越性而被迅速地应用于抗病毒及其相关方面的研究中。RNAi是机体的一种由小分子RNA介导的序列特异性免疫保护性机制,它可以对抗侵入性遗传因子(如病毒

16、、转基因的作用,抑制其复制,减弱或消除其基因毒性。抗病毒治疗研究的主要原理是通过抑制病原体本身的复制及翻译或抑制某些与病毒感染有关的内源性基因的表达来实现。目前多数的研究是通过直接合成特异的siRNA以降解病毒RNA或其mRNA,也有通过RNAi抑制参与病毒复制过程的宿主细胞的某些基因的表达而发挥抗病毒作用。从当前的研究结果发现,RNAi针对不同基因序列都有效,而且特异性强、效率高、操作方便,这为预防治疗病毒感染开辟了一条新途径。同样可以利用特异性的siRNA技术针对病毒主要基因编码区的保守序列或与病毒感染有关内源性基因,设计出特异性的针对靶序列的siRNA,来治疗口蹄疫、禽流感等动物传染性疾

17、病。Ge等11用针对流感病毒核衣壳蛋白(NP和RNA聚合酶A(PA的siRNA不仅抑制了病毒相应的mRNA,而且还间接抑制了所有病毒RNA的转录最近的研究结果发现,siRNA能够阻止病毒在多个感染阶段的复制,包括病毒最易受攻击的感染早期,通过把病毒生命环节中的关键基因作为靶基因,特异性的siRNA/dsRNA与之结合而阻断病毒多个环节的感染。这些研究结果显示了RNAi用于抵御多种病毒感染的潜力。4.4RNAi用于抗肿瘤治疗RNAi能够高效特异的在细胞水平敲除基因。大量实验研究表明,利用RNAi技术特异的抑制癌基因、癌相关基因或者突变基因的过度表达,使这些基因保持在静寂或者休眠状态,从而有望达到

18、抗肿瘤作用。肿瘤的发生是一种多基因协同作用的结果,利用RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达,从而有效抑制肿瘤的生长,达到治疗肿瘤的目的。癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一,多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA,通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法,转入细胞中,可以特异性的封闭这些基因的转录产物。Brummelkamp等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。Salvi等12用RNAi技术沉寂

19、肝癌细胞中u-PA的表达,结果转染靶向u-PA的siRNA的肝癌细胞其侵袭、转移和增殖能力显著下降。Pardridge等13以人表皮生长因子受体( hEGFR为靶点,应用RNAi技术干扰其表达从而抑制颅内肿瘤的生长基于RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大,然而仍有一些问题阻碍了RNAi治疗应用的快速发展,有待未来解决,但对于人类肿瘤性疾病的治疗,它无疑是一条前景光明的新途。5问题与展望虽然RNA干扰技术的研究历程较短,但其发展速度却超乎人们的想象,目前,该项技术还在不断地演进和完善。可以预见,RNAi技术的应用,不仅能大大推进人类后基因组计划的发展,还有可能设计出RNAi芯片,高通量地筛选

20、药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、神经系统研究、生物医学研究等领域,用RNAi技术来抑制基因的异常表达,为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。RNA干扰技术将在后基因组时代中,尤其在疾病基因组学、药物基因组学等研究领域中发挥更为重要的作用。RNAi技术具有极强的优势和广泛的应用前景14,15,但其仍存在一些问题。比如RNAi衰减现象就是一个不容忽视的问题,较低级的植物、真菌、线虫、蠕虫细胞系或成虫中,dsRNA或siRNA产生的RNAi可以稳定表达并产生放大效应,但在较高级的哺乳动物或人类细胞中,尤其是原代细胞,对dsRNA或s

21、iRNA 的导入有时产生拮抗,转染阳性细胞内的RNAi现象亦会在数天之后逐渐消失。并且值得注意的是,大于30bp的dsRNA导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成,结果是非特异性地和全面地抑制基因表达,最终导致细胞凋亡;同时dsRNA诱发的RNAi效应的强度随其浓度的增高而增强,但浓度过高时RNAi效应也会降低。RNAi在各物种中的调控机制复杂,许多涉及RNAi机制的新基因、蛋白及其功能仍未鉴定;靶基因的突变妨碍siRNA对目标RNA的识别,影响RNAi 的效果等等,这些问题的解决,仍有待于人们的进一步探索。参考文献1GuoS,Kemphues KJ.par2l,a gene requued fo

22、r establishing polarityin C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that isasymmetri cally distributed Cell,1995,(4:611-620.2Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific geneticinterference by double2stranded RNA in Caenorhabditis elegansNature,1998,391(6669:806-811.3陈忠斌,于乐成,王升启.RNA

23、干扰作用(RNA i研究进展J.中国生物化学与分子生物学报,2002,18(5:525.4McManus MT,Sharp PA.Gene silencing in mammals by smallinterfering RNAsJ.Nature,2002,3(10:737-747.5Gregory J.Hannon,RNA interferenceJ.Nature,2002,418:244-251.6Vnter J C.AdamsMD,MyersEW,el a1.The sequence of the humangenomeJ.Science,2001,291:1304-1351.7Flei

24、schm ann R D,Adams M D,W hiteO,elnZ.W hole genom erandom sequencing and assembly of Haemophilus influenzaeRd1,J.Science,1995.269:496-512.8Hammond SM,Caudy AA,Hannon GJPost-transcriptionalgenesilencing by double stranded RNAJ.Nature RevGen,2001,2:110-119.9Rubinson D A,DillonCP,Kwiatkowski A V,et al.A lentivirus-basedsystem to functionally silence genes in primary mammalian cells,stem cells and transgenic mice by RNA interferenceJ.Nat Genet,2003,33:401-406.10Kittler R,Buchholz F.RNA interference:gene silencing