《分子生物学》实验指导

1、分子生物学实验指导实验 1 植物总 DNA 的提取生物总 DNA 的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的 生物材料细胞壁的结构和组成不同,而细胞壁结构的破坏是提取总 DNA 的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差 异, 因此不同生物采用的提取方法也不同, 一般要根据具体的情况来 设计实验方法。本实验介绍采用 CTAB 法提取植物总 DNA 的技术。 实验目的 学习和掌握学习 CTAB 法提取植物总 DNA 的基本原理和实验技术。 学习和掌握紫外光吸收法鉴定 DNA 的纯度和浓度。实验原理 植物叶片经液氮研磨, 可使细胞壁破裂, 加入去污剂 (如 CTAB , 可使核蛋

2、白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀, DNA 进入水相, 再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用 CTAB 法,其主要作用是破膜。 CTAB 是一种非离子去污剂, 能溶解膜蛋白与脂肪, 也可解聚核蛋白。 植物材料在 CTAB 的处理下, 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质 变性、 DNA 被释放出来。 CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高 盐(>0.7mM浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl 下 CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋 白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1 抽提去除 蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ,

3、最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂 将 DNA 沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其 衍生物的紫外吸收高峰在 260nm 。纯的 DNA 样品 A260/2801.8,纯 的 RNA 样品 A260/2802.0,并且 1g/ml DNA溶液 A260=0.020。 实验器材 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外 分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶(50ml 9、 滴管 10、细玻棒 11、小烧杯(50ml 12、离心管(50ml 13、植物 材料实验试剂 100mM Tris25mM EDTA1.5M Na

4、Cl3% CTAB2% -巯基乙醇10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿 -异戊醇混合液(24:1, V/V4、 95%乙醇5、液氮实验步骤 1、称取 2g 新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。2、将叶片剪成 1cm 长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉 末。3、待液氮蒸发完后,加入 15mL 预热(60的 CTAB 提取缓冲液, 转入一磨口锥形瓶中,置于 65水浴保温 0.5h ,不时地轻轻摇动混 匀。4、加等体积的氯仿 /异戊醇,盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入 50ml 离心管中,在 4下 8000rpm 离

5、心 10min 。6、离心管中出现 3层,用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离 心管中,弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。 (根据 需要,上清液可用氯仿 /异戊醇反复提取多次。 7、收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入 2倍体积 预冷的 95%乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动,可看到纤维状 的沉淀(主要为 DNA 迅速缠绕在玻棒上。8、小心取下这些纤维状沉淀,加 12 mL 70%乙醇冲洗沉淀,轻摇 几分钟,除去乙醇,即为 DNA 粗制品。9、将粗制品溶于 TE 缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在 260nm/280nm紫外光波长下的光 密度值。实验结果第一组

6、:得到纯化的 DNA ,经紫外分光光度计检测,样品 DNA 溶注意事项 1、液氮研磨时,小心操作,以免冻伤。2、所有操作均需温和,避免剧烈震荡。思考题 CTAB 、 EDTA 、巯基乙醇的作用分别是什么?液氮研磨的原理是什么?实验二 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖,其结构单元是 D-半乳糖 -3,6-L 半乳糖。 许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘 绕形成绳状琼脂糖束, 构成大网孔型凝胶。 该物质对尿素和盐酸胍等 破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在 pH4.0-9.0 的缓冲液中稳定。由 于其分子上无带电基团,在缓冲液离子强度大于 0.05时,对蛋白质

7、无吸附作用,也无电渗现象,因而分辨率和重现性均较好,是一种优 良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,如 DNA 分子的电 泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。 实验目的 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的实验技术和原理,以及溴化 乙锭染色检测核酸的实验技术。实验原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子的高于等电点的 pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移 动。 由于糖 -磷酸骨架在结构上的重复性质, 相同数量的双链 DNA 几 乎具有等量的静电荷, 因此它们能以同样的速度向正极方向移动。 在 一定的电场强度下, DNA 分子的迁

8、移速度取决于分子筛效应, 即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动 速度不一样,可进行分离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的 对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA ,也可以分离相 对分子质量相同,但构型不同的 DNA 分子,如 pUC19质粒,有 3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA (covalently closed circular DNA, 简称 cccDNA ,开环质粒 DNA ,即共价闭合环状质粒 DNA 1条链断裂(open circular DNA ,简称 OCDNA ,线状质粒 DNA ,即共 价闭合

9、环状质粒 DNA2条链发生断裂(linear DNA, 简称 L DNA 。 这 3种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电 泳后呈 3条带, 超螺旋质粒 DNA 泳动最快, 其次为线状 DNA , 最慢 的为开环质粒 DNA 。溴化乙锭可以嵌入核酸分子, 并且在紫外灯下产生荧光, 可用于 检测核酸物质。实验器材 1、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、 DNA marker4、检测样品5、琼脂糖实验试剂 1、 5×TBE (5倍体积的 TBE 贮存液配 1000ml 5×TBE :Tris 54g2、凝胶加样缓冲液(6×溴酚蓝 0.25%蔗

10、糖 40%实验步骤 (一制备琼脂糖凝胶1、按照被分离 DNA 的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参 照下表:琼脂糖凝胶浓度 /% 线性 DNA 的有效分离范围 /kb 0.3 5-600.6 1-202、称取 0.3g 琼脂糖,放入锥形瓶中,加入 30ml 0.5×TBE 缓冲液, 置微波炉或水浴加热至完全溶化, 取出摇匀, 则为 1%琼脂糖凝胶液。 (二胶板的制备1、取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端 边缘封好(一定封严,不能留缝隙 。2、有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。3、将冷到 60左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至 有机玻璃

11、板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡 。4、待胶凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内。5、加入电泳缓冲液至电泳槽中,让缓冲液盖过凝胶。(三加样用移液枪将将上样缓冲液与 DNA 样品按 1:5比例混合,加入加样孔 中(记录点样顺序及点样量 。(四电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极, DNA 片段从负极向正 极移动 。 DNA 的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过 5V/cm。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 12cm处,停止电泳。3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中,染色 30min 。4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。实验结果观察到较为明显的DNA条带,DNA分子量大的

12、条带落后。注意事项 因为 EB 是强致癌物质,因此染色操作中应注意安全不要接触,并且 保持环境的洁净。参考文献 精编分子生物学实验指南 (第四版美 F M奥斯伯, R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005实验三 PCR 基因扩增PCR 技术是在 1985年由美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明的聚合酶链反 应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于 DNA 的体内复制,只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件 -摸板 DNA ,寡核苷酸引物, DNA 聚合酶,合适的 缓冲体系, DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。实验目的 学习和掌握 PCR

13、反应的基本原理与实验技术。实验原理 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在 待扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个 循环后, DNA 扩增 2n 倍。1、变性:加热使模板 DNA 在高温下(94变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链, 即变性阶段。2、退火:使溶液温度降至 5060,模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶 段。3、延伸:溶液反应温度升至 72,耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,在引物的引导 下, 利用反应混合物中的 4种脱氧核苷三磷

14、酸 (dNTP , 按 5 3方向复制出互补 DNA , 即引物的延伸阶段。上述 3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸 3个阶段。从理论上讲,每经过一 个循环,样本中的 DNA 量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过 2530个循环后 DNA 可扩增 106109倍。典型的 PCR 反应体系由如下组分组成:DNA 模板、反应缓冲液、 dNTP 、 MgCl2、两个合成 的 DNA 引物、耐热 Taq 聚合酶。实验器材 1、 PCR 热循环仪 2、 tip 头、冰盒 3、 PCR 管 4、超纯水 5、 DNA 相对分子质量标准物 6、移液枪实验试剂 1、 10

15、5;缓冲液500mmol/l KCl100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室温 15mmol/l MgCl20.1% 明胶2、 4×dNTP1mmol/l dATP1mmol/l dCTP1mmol/l dGTP1mmol/l dTTP3、 Taq 酶 5U/L4、 DNA 模板 1ng/L5、引物 1 、引物 2引物溶液浓度 10pmol/l实验步骤 1、在 PCR 管内配制 20L 反应体系:反应物 体积 /LTemplate 1总体积 202、按下列程序进行扩增:、 95预变性 5min、 95变性 1min、 55退火 1min、 72延伸 1min、重复步骤 3

16、0次;、 72延伸 10min3、琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果配制 0.7%琼脂糖凝胶,取 10L 扩增产物电泳。保持电流 40mA 。电泳结束后,紫外灯下 观察结果。实验结果紫外灯下能明显看到DNA条带。注意事项 1、 PCR 加样时,尽量保持低温操作,避免酶失活和模板、引物降解。2、取样时注意不要污染药品。思考题 1、什么是引物二聚体?出现引物二聚体的原因是什么?2、 PCR 仪的热盖设置有什么优点?参考文献 1、 PCR 技术操作和应用指南 主编 林万明 人民军医出版社 1995年2、 PCR 技术实验指南 美 C.W.迪芬巴赫 G .S. 德维克斯勒 科学出版社 2003年实验四

17、目的基因片段与克隆载体质粒的连接仪器设备:低温水浴锅、冰箱、 T4连接酶、外源 DNA 与酶切的载体等。实验目的:重组 DNA 连接及鉴定重组子的方法。基本要求:学会按一定比例用 T4噬菌体 DNA 连接酶进行连接反应。实验原理及步骤:外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组, 这种重新组合的 DNA 叫做 重组子。重新组合的 DNA 分子是在连接酶的作用下进行连接的。 DNA 连接酶有两种:T4噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。连接反应总体积为 10L,体系组成如下:混均后, 4连接 18-24小时,连接所得克隆载体命名为 TA-VP4-STI 。转化操作方法1取一管

18、 -80保存的感受态细胞,置冰上融化;一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100ul, 应注意所用 DNA 体积不要超过感受态细胞悬液 体积的十分之一。以 100ul 为例:2加入连接物(50ul 的感受态细胞能够被 1ng 超螺旋质粒 DNA 所饱和 ,轻轻旋转离心管 以混匀内容物,冰浴 30min ;3将离心管置于 42热击 60-90秒,然后迅速置冰浴 2-3分钟,该过程不要摇动离心管;4向每个离心管中加入 500ul 液体 LB 培养基(不含抗生素 ,混匀后置于 37摇床振荡培 养 45分钟(150转 /分钟 ;目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。5将离心管内容物混匀,

19、吸取 100ul 已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的 LB 固体琼 脂培养基上(含 50 ug/ml氨苄青霉素 ,用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置 于室温直至液体被吸收,倒置平板, 37培养 12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 涂布用量可根据具体试验来调整:如转化的 DNA 总量较多, 可取更少量转化产物涂布平板; 反之,如转化的 DNA 总量较少,可取 200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少, 可通过离心(4000rpm,2min 后析除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。 (涂 布剩余的菌液可置于 4保存, 如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的

20、菌液再涂布新的培 养板实验结果培养板上有已转化的菌斑生成。注意事项： 1、感受态细胞应保存在-70，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化 效率。 2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。 3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。 4、氨苄青霉素(Amp：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为 50mg/mL。 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体 中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的 接合转移。 如

21、需将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取 外源 DNA。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内 切酶和甲基化酶的突变体(R，M，它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给 后代。 实验目的 学习和掌握 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。 实验原理 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于 0，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转 化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表

22、面， 经 42短时间热 击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使 在转化过程中获得的新的表型（如 Ampr 等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄 青霉素的选择性培养基上。 实验器材 1、超净工作台 2、低温离心机 3、恒温摇床 4、恒温箱 5、恒温水浴器 6、ppendorf 管、Tip 头 7、转化的目的质粒 8、大肠杆菌菌株 DH5 9、试管、培养皿、锥形瓶 实验试剂 1、1mol/l CaCl2 溶液（高压灭菌） 2、LB 液体培养基 配制每升培养基，应在 950ml 去离子水中加入： 胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g 酵

23、母提取液（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解， 用 NaOH 调节 pH 至 7.0， 加入去离子水至总体积 1L， 121 湿热灭菌 20 min。 3、LB 固体培养基 1000ml 加 15g 琼脂。 11 4、氨苄青霉素（Amp） ，用无菌水配制成 100mg/ml 溶液，置-20冰箱保存。 实验步骤 1、从大肠杆菌 DH5 平板上挑取一个单菌落接于 2mL LB 液体培养基的试管中，37振荡 培养过夜。 2、取 0.5ml 菌液转接到一个含有 50ml LB 液体培养基锥形瓶中，37振荡培养 23 h。 （此 时，OD6000.

24、40.5，细胞数务必<108/ml，此为实验成功的关键） 。 3、吸菌液 1ml 加入 Eppendorf 管，10,000rpm 离心 15sec 回收细胞。 4、用冰预冷的 0.1mol/l CaCl2500 L 悬浮沉淀。 5、再离心 15 sec（10000rpm） ，回收细胞。 6、再用冰预冷的 0.1mol/l CaCl260 L 重悬沉淀。 7、在-4下可保存 2 周（24 d 时，转化效率最高） 。 此细胞为感受态细胞。 8、同时做两个对照管： 受体菌对照：60 L 感受态细胞 + 2 L 无菌水 质粒对照：60 L 0.1mol/L CaCl2 溶液 + 2 L 质粒

25、DNA 溶液 9、将管放到 42循环水浴 12min。 10、冰浴 2min。 11、每管加 800 L LB 液体培养基，37培养 1 h（慢摇） 。 12、将适当体积（200 L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。 13、倒置平皿 37培养 1216 h，观察细菌生长情况。 实验结果 在含有氨苄青霉素的培养皿中有菌斑生成 注意事项 1、超净上无菌操作注意安全。 2、实验过程中尽量避免杂菌污染。 思考题 1、CaCl2 制备感受态的可能原因是什么？ 2、如果平板培养后出现卫星斑的可能原因是什么？ 3、如何提高转化的效率？ 参考文献 精编分子生物学实验指南 （第四版） 美 F

26、M 奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005 部分试剂配法： 配制 1MTris-HCl（中文名：三羟甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，缓血酸铵）, pH8.5， 500ml ， 配法是： 60.55g Tris + 400ml H2O + 约 20 ml 浓 HCl，pH 调至 8.5，定容至 500ml. EDTA 标准溶液的配制与标定 1.EDTA 标准溶液的配制（约 0.02mol· L-1） 12 称取 2.0g 乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y· 2H2O）溶于 250mL 蒸馏水中，转入聚乙烯塑料 瓶中保存。 2.EDTA 标准溶液浓度的标定 用 20mL 移液管移取 Mg2+标准溶液于 250mL 锥形瓶中，加入 10mL 氨性缓冲溶液和 34 滴 EBT 指示剂，用 0.02mol· L-1EDTA 标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为蓝色即为终 点。平行标定 3 次。 1）2×CTAB 提取液（PH 8.0） ：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巯 基乙醇。 即称取 CTAB 2 g 加蒸馏水 40ml， 加 1M Tris-cl （PH8.0） 10ml， 0.5M EDTA （PH 8.0） 4ml 和 5M NaCl 28ml,待 CTA