课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数自读教材夯基础1. 筛选菌株的思路(1) 自然界中目的菌株的筛选： 依据：根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。 实例：PCR技术过程中用到的耐高温的 Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的 Taq 细菌中提取出来的。(2) 实验室中目的菌株的筛选： 原理：人为提供有利于 生长的条件(包括等)，同时的生长。 方法：利用选择培养基分离。a. 选择培养基：允许 微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。b. 实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以 作为唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。2 .统计菌落数目(1) 常用方法：法。 原理： 计数原

2、则：一般选择菌落数在 的平板进行计数。 结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 是(2) 其他方法:1.阅读教材P22第一段旁栏中的相关内容，并思考回答下列问题。(1) 从物理性质上划分，此培养基属于哪类培养基？从功能上划分呢？(2) 在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质?(3) 该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？2 阅读教材P22中部楷体字部分，思考：哪位同学的结果更接近真实值？他们的实验需要改进吗？如果需要，如何改进?3阅读教材P23上部的楷体字部分，请帮助 A同学设置对照实验，以排除其他同学所质 疑的可能影响实验结果的因素。跟随名

3、师解疑难1 选择培养基的类型及作用(1) 在培养基中加入某种 。如加入青霉素可以分离出 加入可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上加入。(2) 改变培养基中的 。如培养基中 时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。(3) 改变微生物的。如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。2 统计菌落数目(1) 稀释涂布平板法： 原理： 注意事项：a.设置重复组：同一稀释度下， 作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑 ，结果不一致，意味着操作有误，需要b .设置对照：目的

4、是 计算公式：每克样品中的菌株数=。C :代表。V :代表。M : 。（2）显微镜直接计数法：原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在 下计算一定容积的样品中微生物的数量。 缺点：。 方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成 25个（或16个）中格，每个中格进一 步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由 400个小格组成的。如下图所示：OU rwnL血坪计数扱正面血球计数板恻血计数叙0tinuiHr）盖Ifc片 计算公式：每毫升原液所含细菌数=实验设计及操作提示自读教材夯基础1 实验设计流

5、程 土壤要求：富含Q冇机质,pH 接近地且潮湿 取祥部僮土距地義约3 b era的土壤层 稀释原因：样品的曙耗程度直 接影响平板上牛一隹的4菌落数冃 稲释标准：选用一定稀释范團 的样品液进行培养畀呆证获得菌落 数在囚恥3G0之间，便于计数 培养鬲福的微生物.往往 需要不同的培养同温度和培养 U时间 观察匸毎隔24 h统卄一抚菌落 数目，;ft后选取E数旦稔崖时的 记录柞为结果岂菌落数目稳定时*取同一画壘 释度下的3个平板进行计数，求出 囲平均值*井根据所对应的E)稀 登理计算出样陆中细菌的数目2. 菌种鉴定原理：分解尿素的细菌合成的 将分解为，使培养基的 增强。(2) 方法：在以 为唯一氮源的

6、培养基中加入 指示剂培养细菌，若指示剂，可确定该种细菌能够分解尿素。1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度?2 当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些?3 .为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果?跟随名师解疑难1.操作中的注意事项(1) : 。称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在 旁进行。(2) :如在培养皿上注明 、以及等。2 结果分析与评价H 容现象结论有无杂菌污染的判断选择培养基的筛选作用样品的稀释操作重复组的结果例1下表是某微生物培养基的配方。请分析回答下列问题:编号成分(NH 4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4 g4.0

7、 g0.5 g0.5 g100 mL从培养基的营养成分看，此培养基可用来培养的微生物同化作用类型是。利用该培养基培养微生物时，微生物所需要的碳源来自 。(2) 此表中含有的微生物的营养成分包括 。(3) 若除去该培养基中的后再加入不含氮元素的有机物，则此培养基可培养的微生物种类是。(4) 培养基若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是 。(5) 若要观察微生物的菌落的特点，培养基中还应添加的成分是 。归纳拓展卩几种常见微生物的分离方法根据选择培养的菌种的生理代谢特点，加入某种物质或不加入某种物质以达到选择的目 的。常见微生物的分离举例如下： 酵母菌、霉菌等真菌：用含 的培养基分离; 金黄色葡萄球菌

8、：用含 的培养基分离； 固氮微生物：用 的培养基分离； 自养型微生物：用含 的培养基分离； 厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在 下分离。微生物的分离与计数例2自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。实验步骤：(1) 制备稀释倍数为10(4) 某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该 大肠杆菌的品系被污染了？为什么？随堂基础巩固1在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 的培养基称作()A 鉴别培养基B.加富培养基C

9、.选择培养基 AB（3）示意图A和B中，表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。课时跟踪检测一、选择题（每小题3分，共24分）1 下列关于土壤取样的叙述错误的是（）A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B. 先铲去表层土 3 cm左右，再取样C. 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D .应在火焰旁称取土壤2 可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（）A 以尿素为唯一氮源

10、的培养基中加入酚红指示剂B .以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹川试剂D 以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂3 用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（）、10 .某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细、10菌。下列操作错误的是()、105、106的系列稀释液。(2) 选用法接种样品。(3) 适宜温度下培养。 结果分析：(1) 测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是()A .一个平板，统计的菌落数是23B 两个平板，统计的菌落数分别是22和26,取

11、平均值24C.三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D .四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25,取平均值25(2) 一同学在稀释倍数为 105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)。D.基(3) 用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量 ,因为C.TTTD.TTTA 称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁B 用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选C.分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种D 对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种4 （2014新课标H ）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定

12、了该河流水样中的细菌 含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌 后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是A 未接种的选择培养基B 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.接种了的选择培养基D .接种了的牛肉膏蛋白胨

13、培养基4. 在土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验操作中，对使用的平板和试管要进行标记,以下说法正确的是（）A .对培养皿仅需注明培养基的种类即可B .一般在使用之后进行标记C.由于试管用得较多，只需对试管进行标记即可D .标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆5. 下列关于 检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，错误的是 （）A .用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B .取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL ,分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 C恒温培养2448 hD .利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进

14、行计数6 .通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养 基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养 基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。禾U用上述方法能从混杂的微生物群体中分别 分离出（）大肠杆菌 霉菌放线菌固氮细菌A .C.B .D .只有7 .分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（）加尿素不加尿素 加琼脂不加琼脂 加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐A .B .C.D .8.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用 3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线（3条线均与图中的链霉素带接触），将平板置

15、于37 C条件下恒温培养 3天,结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述错误的是（）A 链霉素能阻止结核菌的生长B 链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C.链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效D 链霉素可以用于治疗伤寒病人二、非选择题（共26分）图乙是脲酶基因转录的 mRNA部分序9. （12分）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程, 列。屮鉴別 培猱晶 歯种GITGAGAAAlJinTGGir10 0 细菌选肆I：壊杆-応培诉菇 培昴帚即1 （表示从握始密码开贻毎起的碱施序号）乙（1）图中选择培养基应以 为唯一氮源；鉴别培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成

16、色。（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液 0.1 mL , 培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是 ,每克土壤样品中的细菌数量为 M08个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较 。10. （14分）尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：（1）对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要 （填 消毒

17、”或灭菌”。第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而则不能生长繁殖。（2）若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数。（3）若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在如表所示培养基配方中添加的物质是 、。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中 pH升高使酚红指 示 剂 变为 红 色， pH 升

18、高 的原 因 是成分KH 2PO4Na2HPO4MgSO 47H2O酚红指示剂尿素蒸馏水培养基（含量）1.4 g2.1 g0.2 g0.01 g1.0 g1 000 mL11. 下图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，请据图回答:逐级10g 细菌选择签别菌种土填样品培养基 培养基 培养基（1）无菌技术是微生物培养和鉴别的关键，在对培养基进行灭菌时，应采用的方法是。为检测培养基灭菌是否彻底，应进行的操作是 。（2） 上图中选择培养基应以 作为唯一氮源；鉴别培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后， 其菌落周围的指示剂将变成 色。（3） 若要估算试管中菌种的数量，除了采用显微镜直

19、接计数的方法外，还可采用法进行计数，该方法测得的值与实际值相比一般会 （填 偏大” 偏小”或 相等”），其原因是。12. 为了探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分及用量（g）如下表所示，实验步骤如下图所示。请分 析回答问题。KH 2PO4Na2HPO4MgSO4 7H2O葡萄糖尿素琼脂1.42.10.211015将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mLI 芒0 OD-辎杆倡数为(i)在脲酶作用下尿素分解的反应式是(2)培养基中加入尿素的目的是筛选 ，这种培养基属于 培养基。，实验 目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自

20、培养基中的 和中需要振荡培养的目的是 (4) 转入固体培养基时，常采用 接种，获得单菌落后继续筛选。(5) 实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。13.某生物兴趣小组想对土壤中能分解尿素的细菌进行分离，并统计每克土壤样品中的活菌数目，确定了培养基配方(如下表)。将配方中各种物质溶解后，用蒸馏水定容到I 000 mL ,再经高温灭菌，制成固体培养基以备用。KH 2PO4Na2HPO4MgSO4 7H2O蛋白胨葡萄糖尿素琼脂11.4g2.1g0.2g1.0g10.0g1.0g15.0g(1 )为保持干燥，培养皿用 法灭菌；待培养基冷却到 C (填“ 20”“ 30”或“400左右时

21、，在酒精灯附近倒平板；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，可以防止，防止造成污染。(2)根据培养基的成分判断，该同学不能分离出土壤中分解尿素的细菌，原因是(3) 该同学采用稀释涂布平板法检测样液中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ;然后，将I mL样液稀释I00倍，在3个平板上用涂布法分别接入0. 1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为 39、38和37,据此可得出每升样液中的活菌数为 。(4) 若该同学采用显微镜直接计数法测量细菌数量，左下图是一块血细胞计数板正面示意图，其上有个计数室。右下图是计数室中一个中格的细菌分布示意

22、图，该中格内细菌数量应计为。0*1 mm* V*JXR-K-25课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数答案生存环境目的菌株营养、温度、pH抑制或阻止其他微生物特定阻止或抑制尿素脲酶 稀释涂布平板原理略 30300低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落利用显微镜直接计数提示：固体培养基，因为加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基。提示：碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素。提示：该培养基对微生物有选择作用。该培养基以尿素为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。提示：第一位同学只涂布了1个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3

23、个平板，但是，其中 1个平板的计数值结果与另 2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，这两位同学的实验都需要改进。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的 结果是否一致。结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。可能原因实验验证结论所取土样不同其他同学用与A同学一样的土样进 行实验若结果与A冋学的一致，则说明A无误； 若结果与A同学的不一致，则说明A同 学操作失误或培养基配制有问题培养基污染或操作失误将A同学配制的培养基在不加土样 的情况下进行培养，作空白对照

24、若有菌落出现，则说明培养基污染；若 无菌落出现，则说明未被污染化学物质酵母菌和霉菌高浓度的食盐营养成分 缺乏氮源培养条件当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。至少涂布3个平板重复组的结果是否一致重新实验排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度（C说/） WI某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积代表稀释倍数显微镜不能区分细菌的死活每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数400 X10 000稀释倍数脲酶尿素氨碱性尿素酚红变红 提示：土壤中各类微 生物的数量不同，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时 还应当有针对性地提供选择培养的条件。提示：为确保能从中选择出菌落数在30300之间的平板进行计数。提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。无菌操作铁铲和信封都要灭菌酒精灯的火焰做好标