氟硼二吡咯-叶酸光敏剂的制备及其体外光动力活性研究

1、氟硼二吡咯-叶酸光敏剂的制备及其体外光动力活性研究Mei-Rong Ke, Sin-Lui Yeung, Dennis K. P. Ng,Wing-Ping Fong,and Pui-Chi Lo香港中文大学，生命科学学院，化学系。文摘：制备了两种共轭体系延长的氟硼二吡咯光敏剂并用各种光谱分析方法进行了表征。相比于人类乳腺癌MCF-7细胞，这些偶联物对高表达叶酸受体的人类鼻咽癌KB细胞展现出更高的光细胞毒性。含更短的寡甘醇链的偶联物（化合物11a），由于有更高的细胞吸收活性及稍低的聚合趋势，因此对这两种癌细胞株的光细胞毒性有特别大的区别，其对KB细胞的IC50值(0.06M)比MCF-7低了4

2、3倍,而相比于另一个含更长链的同类物（化合物11b），IC50值只低了六倍。链的长度也会影响他们的亚细胞定位，化合物11a对KB细胞的内网显示高亲和力,化合物11 b则主要是定位于溶酶体上。1.引言：开发出新颖高效的光动力治疗光敏剂(PDT)1-4已成为学术界的研究热点，除了经典的四吡咯衍生物，如卟啉、卟吩、脱镁叶绿酸和酞菁，氟硼二吡咯（BODIPY）衍生物也有成为光敏剂的希望，这归因于它们可通过化学方法改变骨架获得理想的光学及光物理性质，以及即使在水介质中也具有的相对高稳定性。然而这一领域的研究并没有被充分地发展起来。如最近的两篇评述文章所报道的，大部分的BODIPY光敏剂仅限于吸收带在近红

3、外区的硫唑嘌呤-BODIPY，而那些非硫唑嘌呤类BODIPY则很少被研究，尽管它们在被适当修饰后吸收带也位于近红外区，并表现出优越的光动力活性，而且在内消旋位置也可以引入一个额外的功能基团。我们最近报道了一系列聚乙二醇联苯乙烯BODIPY衍生物，他们的细胞摄取、亚细胞定位和光细胞毒性受苯乙烯基取代基影响很大。其中含五个三乙二醇链的化合物对人类大肠癌HT29细胞显示出了最高的效力，其IC50仅为7nM。作为本研究的扩展,在此我们报告两个在内消旋位置与叶酸通过三唑环桥寡甘醇链接的类似物,包括他们的制备和体外光动力活性。我们也研究了链的长度对其性质的影响。在高效光敏剂的开发方面，一个主要的挑战是提高

4、选择性，以使它们可以优先定位在肿瘤部位并发挥功效。一个常见的策略是通过直接共轭结合目标配体,如单克隆抗体、蛋白质,多肽,类固醇和叶酸10-12。在这些药物靶向性载体中，叶酸特别引人注意，这是因为他们的低分子量、高稳定、高组织渗透性,和非致敏性，更重要的是，那些真核细胞生物合成核苷酸所需的基于蝶呤的维生素对叶酸受体有很高的亲和力，这在大多数上皮癌细胞中表现的非常明显，但在正常组织中并不如此。因此，作为一个提高药物肿瘤选择性的有效方法，叶酸作为各种成像和治疗药剂载体已被广泛研究。有潜在应用于PDT的叶酸共轭的许多光敏剂已见报道，包括卟啉、脱镁叶绿酸、卟吩、细菌叶绿素和包埋光敏剂的量子原子团以及纳米

5、粒子。我们相信,通过叶酸-苯乙烯组联BODIPY，得到的偶联物能表现出更强的肿瘤选择性,从而有利于靶向PDT。2.结果和讨论2.1合成和表征线路图1显示了这些偶联物的合成路线。首先用羟基BODIPY130与溴丙炔2或炔基甲苯磺酸盐3在K2CO3存在下于丙酮中反应得到相应的取代产物4a和4b。为了通过重原子效应促进系间窜越和单线态氧的生成，化合物4a和4b分别通过在乙醇中与碘和碘酸混合反应得到相应产物5a和5b。然后通过Knoevenagel缩合反应与对三乙二醇苯甲醛632反应得到联苯乙烯BODIPY化合物7a和7b。这一修饰可以延长它的共轭体系使吸收带转移至红色,从而有利于光渗透到组织中。乙二

6、醇链则用于提高此染料的亲水性、生物相容性和细胞摄取率。然后将叶酸8与2-【2-（2-叠氮乙氧）乙氧基】乙胺9在DCC和吡啶存在下于DMSO中反应得到同分异构体-和-酰胺基的叠氮叶酸10，如高效液相色谱分析（图1）所示，这两个同分异构体的比例约为3:7，这是由于叶酸的-羧基的空间位阻较小，反应活性高因此以酰胺在位的产物（如线路图1中所示）为主，这与其他文献的报导相符。20,33,34这两种混合物未经分离，直接与炔基联苯乙烯BODIPYs 7 a和7 b进行点击反应，分别得到化合物11a和11b。这两个化合物通过高效液相色谱纯化并用紫外-可见特征光谱和高分辨率电喷雾（ESI）质谱进行了表征。如图S

7、1b和S1c所示，与10的信号相比，11a和11b信号的分辨率不高，尤其是11b。所有其他新化合物也都用各种光谱学分析方法和元素分析方法进行了充分的表征。2.2.电子吸收及光物理性质我们在DMF中测定了11a和11b的紫外可见光谱，两个光谱在662nm有一个强的Q带，并严格遵守朗伯-比尔定律，这表明这两种偶联物在DMF中的聚合效应并不明显。在610nm激发波长下，这些偶联物在687nm（11a）或689nm(11b)发射荧光，其荧光量子产率（F）为0.20，相对于未取代锌（II)酞菁(ZnPc) (F = 0.28)35，这些化合物的荧光发射较弱，这归因于两个碘原子促进了系间窜越并减少了通过荧

8、光发射弛豫的可能。36其电子吸收和荧光数据如表1所示。 为检测这些化合物的光敏效率，我们在DMF中用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕捉剂对它们的单线态氧量子产率进行了研究。这个猝灭剂的光降解速率是通过监控其在415nm波长的吸光度随时间的变化测定的。在图S3中可以看到，这两种偶联物的单线态氧量子产率与常用参考物ZnPc是相当的。2.3体外研究化合物11a和11b体外光动力活性是以高表达叶酸受体(FR+)37的人类鼻咽癌KB细胞和低表达叶酸受体(FR-)38的MCF-7细胞为受体研究的。其剂量-生存曲线如图1所示。这两种化合物在黑暗环境中基本没有细胞毒性，而在光照下则都呈现出了

9、细胞毒性。11a的光细胞毒性强度（对KB细胞的IC50 = 0.06 M，对MCF-7 细胞的 IC50 = 2.56 M)和11b的光细胞毒性强度（对KB细胞的IC50 = 0.18 M，对MCF-7 细胞的 IC50 = 1.00 M)明显随细胞种类而变，相比之下，光毒性更强的不含叶酸的BODIPY7b其差别较小（对KB细胞的IC50 = 0.02 M，对MCF-7 细胞的 IC50 = 0.06 M)。一般来说，KB细胞较MCF-7细胞更易受光动力作用影响。值得一提到的是，11a对这两种癌细胞的光毒性强度的差别非常大，其对KB细胞的IC50值比MCF-7细胞低了43倍，而化合物11b只低

10、了6倍，7b只低了3倍。这些结果表明这两个叶酸修饰的光敏剂11a和11b对FR+KB细胞展现了更高的亲和力，其选择性和光细胞毒性强度依赖与介于光敏剂和叶酸之间的乙二醇链的长度，乙二醇链较短的偶联物11a表现出对KB细胞更强的靶向性和更高的光细胞毒性。连接链对其他一些叶酸修饰的抗肿瘤药剂的影响也被研究过。17,39,40例如Guaragna等人制备了两种分别通过氨基乙基和伪-缩二氨酸连接叶酸的抗癌药物苯丁酸氮芥，并用三种FR+和FR-白血病细胞株评估的它们的细胞特异性和细胞毒性。39结果表明，这两种化合物对FR+细胞展现了高的特异性而且它们的抗肿瘤活性与未被修饰的苯丁酸氮芥相当。相比之下，在一系

11、列的带有二硝基苯基作为半抗原基团的叶酸修饰的化合物中，它们的抗肿瘤活性和潜在致敏性的变化则取决于连接链，尽管它们对叶酸受体有相近的亲和力。40对于Schneider等人报道的两种叶酸-卟啉偶联物，17发现连接链为乙二醇基的化合物比另一个连接链为烷基的化合物显示出更强的光细胞毒性，它们的半抑制光剂量值相差三倍。我们的研究结果表明，对于叶酸偶联物，即使性质相同，连接链的不同长度也会对其特异性和细胞毒性产生显著的影响。为了进一步揭示叶酸基团的靶向作用，我们进行了对照实验，将FR+KB细胞与11a（0.06M，即其IC50值）和游离叶酸（0.50M）共培养24h，然后进行光动力疗法实验。发现细胞存活率

12、从50%上升至94%，这一结果清楚地表明增加游离叶酸会减少细胞对11a的摄取，从而降低它的光细胞毒性。为解释11a和11b不同的光细胞毒性强度，我们通过紫外-可见光谱和荧光光谱研究了它们在RPMI琼脂培养基中的聚合行为，如图2所示，与11a的相比，11b的Q带因吸收峰左肩增强而变宽，其荧光发射也稍微减弱。这表明在琼脂培养基中11b较11a的聚合倾向稍大，也许是因为额外的三乙二醇链与邻近的寡甘醇链产生了偶极-偶极相互作用。它们的光细胞毒性也可以通过荧光显微镜观察KB细胞对它们的摄取来进一步论述。这些细胞先与11a或11b一起培养24h，然后分别拍摄亮视场图像和荧光图像（图3a）,从而得到细胞内的

13、平均荧光强度（图3b）。可见11a的细胞内荧光比11b强得多（大约3倍），这意味着更多的细胞摄取。因此，11a对KB细胞的更高的光细胞毒性可归因于在生物环境中较高的细胞摄取率和较低的聚合倾向，从而提高单线态氧量子产率。8,9为了评估11a中叶酸基团的靶向性质，我们用FR+KB和FR-MCF-7细胞进一步测定了其细胞摄取率。在于11a共培养24h后，KB细胞显示出强的细胞内荧光，而MCF-7细胞则明显较弱（图4a）。KB细胞的平均荧光强度是MCF-7细胞的5倍（图4b）.这一结果表明11a中的叶酸基团可以促进联苯乙烯BODIPY光敏剂进入高表达叶酸受体的肿瘤细胞中。我们也研究了11a和11b在K

14、B细胞中的亚细胞定位。这些细胞先与这两个化合物一起培养24h，然后分别用Lyso-Tracker DND 26, Mito-Tracker Green FM, 和ER-Tracker Green (15 min)染色,这些染料分别是特异性的溶酶体、线粒体、内质网的荧光染料。如图5所示，11a产生的荧光与ER-Tracker产生的荧光相重叠，与Lyso-Tracker的荧光部分重叠，而与Mito-Tracker的荧光不重叠，这表明化合物11a对内质网有很高的亲和力，也可以吸附到溶酶体上。而11b则倾向于积累在溶酶体上，部分在内质网。因此，连接链的长度也影响该化合物的亚细胞定位。2.4结论我们制备

15、并表征了两种叶酸-联苯乙烯BODIPY化合物并研究了它们的体外光动力活性。相比于FR-MCF-7细胞，两种化合物都对FR+KB细胞表现出更高的光细胞毒性，尤其是11a，它对KB细胞的IC50比对MCF细胞低43倍。此外，连接联苯乙烯BODIPY与叶酸的链的长度也影响它们的聚合倾向、细胞摄取和亚细胞定位，从而导致不同的光细胞毒性效果。链更短的11a更为有效，对于靶向PDT是一个很有前途的光敏剂。3.实验部分一般来说，所以反应都是在氮气气氛下进行的。DMSO以氢化钙减压蒸馏，THF和甲苯则分别用钠-二苯甲酮和钠蒸馏。通过硅胶色谱柱（70-230目）和相应洗脱液进行纯化，尺寸排阻色谱法则是用Bio-

16、Rad Bio-Beads S-X1beads(200-400目)以THF为洗脱液。所以其他溶剂和试剂都是试剂纯级的并直接使用的。化合物130，331和632按文献方法制备。1H和13C1HNMR是在CDCl3中用Bruker AVANCE III 400光谱仪（1H，400，13C，100.6MHz）。核磁共振谱是用SiMe4作为标准物（1H, = 7.26，13C, = 77.2)。ESI质谱是用Thermo Finnigan MAT 95 XL质谱仪测量的。元素分析是由上海有机化学研究所做的。紫外-可见和稳态荧光光谱分别是在Cary 5G UVvisNIR分光光度计和Hitachi F-

17、7000荧光光谱仪上测定的。样品的荧光量子产量(F)是由方程F(sample) =(Fsample/Fref)(Aref/Asample)(n2sample/n2ref)F(ref)41计算的，ZnPc是在DMF中按文献作为参考F(ref) = 0.28。35为减少背景物质对辐射的吸收，发射光谱是在极稀溶液中获得的，其吸光度在610nm约为0.04。反相高效液相色谱法是在Apollo-C18色谱柱 (5m,4.6毫米×250毫米)或XBridge-C18色谱柱(5m,10毫米×250毫米)上用日本岛津公司CBM-20A控制器SPD-M20A二极管阵列作为检测器进行的。条件设

18、置为:溶剂A= 0.1%三氟乙酸(TFA)-蒸馏水;溶剂B =乙腈。净化参数为：前7分钟90% A + 10% B to 0% A + 100% B，然后在23分钟内改为0% A + 100% B并保持3分钟，然后在2分钟内改为90% + 10%,最后保持在这个条件5分钟。流量固定在4.0毫升每分钟。分析参数如下：90% A + 10% B 在35分钟内变为 0% A + 100% B并保持15分钟，然后在两分钟内改为90% A + 10% B并保持3分钟。流量固定在0.8毫升每分钟。 1,3,5,7-四甲基-8-（4-炔丙氧苯基）-氟硼二吡咯（4a）：将BODIPY1(0.50 g, 1.4

19、7 mmol),溴丙炔(2) (0.87 g, 7.35 mmol),K2CO3 (1.02 g, 7.38 mmol)混合于丙酮（30ml）中加热回流7h。然后抽真空除去挥发物。残留物与水（100ml）混合，然后用CH2Cl2（50ml*3）萃取。有机相合并后用Na2SO4干燥并减压蒸干。用硅胶柱层析纯化，以己烷-CHCl3(3:2,v / v)作为洗脱液，得到橙色固体(0.51克,91%)。1H NMR (CDCl3): 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2 H,ArH), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 5.98 (s, 2 H, pyrrole-

20、H), 4.76(d, J = 2.4 Hz, 2 H, CH2), 2.56 (s, 7 H, CH3 and CH), 1.42 (s, 6 H,CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 158.2, 155.5, 143.2, 141.6, 131.9,129.3, 128.1, 121.3, 115.7, 78.1, 76.0, 56.1, 14.7. MS (ESI): m/z 401M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/z calcd for C22H21BF2N2NaOM + Na+ 401.1607, found 401.1614. Anal. C

21、alcd for C22H21BF2N2O:C, 69.86; H, 5.60; N, 7.41. Found: C, 69.72; H, 5.46; N, 7.42.1,3,5,7-四甲基-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-氟硼二吡咯（4b）：如4a步骤，将BODIPY 1(0.15 g, 0.44 mmol)、炔基甲苯磺酸盐3 (0.30 g, 0.88 mmol) 和 K2CO3 (0.18 g, 1.32 mmol) 在丙酮中反应的4b，由硅胶柱层析纯化，以己烷/乙酸乙酯(3:2,v / v)作为洗脱液。得到橙色粘性固体(0.14克,63%)。1H NMR (CD

22、Cl3): 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH),7.01 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 5.96 (s, 2 H, pyrrole-H), 4.20 (d, J =2.4 Hz, 2 H, CH2), 4.17 (t, J = 4.4 Hz, 2 H, CH2), 3.90 (t, J = 4.4 Hz, 2H, CH2), 3.753.77 (m, 2 H, CH2), 3.693.73 (m, 6 H, CH2), 2.54(s, 6 H, CH3), 2.42 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.41 (s, 6 H,

23、 CH3).13C1H NMR (CDCl3): 159.3, 155.1, 143.1, 141.8, 131.7, 129.0,127.0, 121.0, 115.1, 79.6, 74.6, 70.7, 70.5, 70.3, 69.6, 69.0, 67.4, 58.3,14.5, 14.4. MS (ESI): m/z 533 M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/zcalcd for C28H33BF2N2NaO4 M + Na+ 533.2399, found 533.2391.Anal. Calcd for C28H33BF2N2O4: C, 65.89;

24、 H, 6.52; N, 5.49. Found: C,65.59; H, 6.54; N, 5.45.1,3,5,7-四甲基-8-（4-炔丙氧苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（5a）：将碘酸(0.47 g, 2.64 mmol)溶于少量水中后与BODIPY 4a (0.50 g, 1.32 mmol)和碘(0.84 g, 3.31 mmol)一起加入乙醇（40ml）中。50加热2h。冷却后，减压蒸馏，油状产物用硅胶柱纯化，洗脱液为己烷/ CHCl3(3:2,v / v)，得到明亮的红色固体(0.64克,77%)。1H NMR (CDCl3): 7.17 (d,J = 8.8 Hz, 2 H,

25、ArH), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 4.78 (d, J = 2.4Hz, 2 H, CH2), 2.64 (s, 6 H, CH3), 2.57 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.44(s, 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 158.6, 156.8, 145.5, 141.3,131.8, 129.2, 127.7, 116.1, 85.8, 78.0, 76.2, 56.2, 17.3, 16.2. MS (ESI):m/z 630 M+ (48%) and 611 M F+ (70%). HRMS

26、(ESI): m/zcalcd for C22H19BF2I2N2O M+ 629.9646, found 629.9650. Anal.Calcd for C22H19BF2I2N2O: C, 41.94; H, 3.04; N, 4.45. Found: C,41.70; H, 3.01; N, 4.45. 1,3,5,7-四甲基-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（5b）：与5a相同，将BODIPY 4b(0.40 g, 0.78 mmol) 与碘酸(0.28 g, 1.57 mmol)和碘 (0.50 g, 1.96 mmol) 加入 EtO

27、H (50 mL)中得到5b，用硅胶柱分离，以CH2Cl2/CHCl3 (1:1, v/v)洗脱得到红色粘性固体(0.48 g, 80%). 1H NMR (CDCl3): 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 4.21 (d, J = 2.4 Hz, 2 H,CH2), 4.20 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.92 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2),3.763.79 (m, 2 H, CH2), 3.713.73 (m, 6 H, CH2), 2.64 (s,

28、 6 H,CH3), 2.43 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.43 (s, 6 H, CH3). 13C1HNMR (CDCl3): 159.7, 156.4, 145.3, 141.5, 131.6, 128.9, 126.6,115.4, 85.6, 79.6, 74.7, 70.8, 70.5, 70.4, 69.6, 69.0, 67.5, 58.3, 17.2,16.0. MS (ESI): m/z 785M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/z calcdfor C28H31BF2I2N2NaO4 M + Na+ 785.0343,

29、found 785.0343. Anal.Calcd for C28H31BF2I2N2O4: C, 44.12; H, 4.10; N, 3.68. Found: C,44.08; H, 4.10; N, 3.69.1,7-二甲基-3,5-二（4-（3,6,9-三氧代奎氧基）苯乙烯基）-8-（4-炔丙氧苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（7a）：将5a (0.45 g, 0.71 mmol)，取代苯甲醛6(0.46 g, 1.71 mmol),冰醋酸(2.0 mL, 34.9 mmol),哌啶 (2.4 mL, 24.3 mmol)和少量Mg(ClO4)2 加入甲苯(60 mL)中加热回流过夜。

30、反应过程中生成的水由分水器除去。混合液经减压蒸馏后用硅胶柱分离，洗脱液为CH2Cl2/甲醇(100:1,v / v).收集绿色带并旋蒸干，然后由尺寸排阻层析进一步纯化，使用Bio-beads S-X1beads，四氢呋喃作为洗脱液。油状产物再用硅胶柱以CH2Cl2/甲醇(100:1,v / v)洗脱，得到深绿色固体(0.20克,25%)。1H NMR (CDCl3): 8.13 (d,J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 7.58 (d, J =16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.20 (d, J = 8.8 H

31、z, 2 H, ArH), 7.13 (d, J = 8.8Hz, 2 H, ArH), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 4.79 (d, J = 2.4 Hz, 2H, CH2), 4.19 (t, J = 4.8 Hz, 4 H, CH2), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 4 H,CH2), 3.753.78 (m, 4 H, CH2), 3.663.72 (m, 8 H, CH2), 3.553.58(m, 4 H, CH2), 3.39 (s, 6 H, CH3), 2.58 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.50(s,

32、 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 160.0, 158.5, 150.5, 145.8,139.2, 138.3, 133.3, 129.8, 129.3, 128.3, 116.8, 116.0, 115.1, 82.8, 78.0,76.2, 72.0, 71.0, 70.8, 70.7, 69.8, 67.6, 59.2, 56.2, 17.8 (some of thesignals are overlapped). MS (ESI): m/z 1153 M + Na+ (55%).HRMS (ESI): m/z calcd for C50H55BF2I2N2

33、NaO9 M + Na+1153.1959, found 1153.1970. Anal. Calcd for C50H55BF2I2N2O9: C,53.12; H, 4.90; N, 2.48. Found: C, 52.73; H, 4.88; N, 2.50.1 ,7-二甲基-3,5-二（4-（3,6,9-三氧代奎氧基）苯乙烯基）-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（7b）：如7a所述，BODIPY 5b (0.20 g, 0.26 mmol)与取代苯甲醛6 (0.17 g, 0.63 mmol)，冰醋酸(1.0 mL, 17.5 mmol)

34、,哌啶(1.2 mL, 12.1 mmol)和少量Mg(ClO4)2 加入甲苯 (50 mL)中反应得到7b，纯化方法同上，得到深绿色固体(0.13克,40%)。1H NMR (CDCl3): 8.12 (d, J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.59 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH),7.58 (d, J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.15 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH),7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 4.22 (d,J =

35、 2.4 Hz, 2 H, CH2), 4.174.21 (m, 6 H, CH2), 3.92 (vt, J = 4.8 Hz,2 H, CH2), 3.89 (vt, J = 4.8 Hz, 4 H, CH2), 3.653.79 (m, 20 H,CH2), 3.553.57 (m, 4 H, CH2), 3.38 (s, 6 H, CH3), 2.44 (t, J =2.4 Hz, 1 H, CH), 1.49 (s, 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 160.0, 159.8, 150.4, 145.8, 139.1, 138.7, 133.3, 129.8

36、, 129.7, 129.3,127.5, 116.9, 115.6, 115.1, 82.7, 79.7, 77.4, 74.7, 72.0, 71.0, 70.7, 70.6,69.8, 69.2, 67.7, 67.6, 59.1, 58.5, 17.8 (some of the signals areoverlapped). MS (ESI): m/z 1285 M + Na+ (100%). HRMS (ESI):m/z calcd for C56H67BF2I2N2NaO12 M + Na+ 1285.2746, found1285.2732. Anal. Calcd for C5

37、6H67BF2I2N2O12: C, 53.27; H, 5.35; N,2.22. Found: C, 53.16; H, 5.26; N, 2.25. 叶酸-二苯乙烯BODIPY11b：如11a所述，BODIPY7b(30.0 mg, 23.8 mol)和叠氮叶酸10 (21.3 mg, 35.6 mol), CuSO4·5H2O(0.9 mg, 3.6 mol)以及抗坏血酸钠(1.4 mg, 7.1 mol)于DMSO和水(15:1, v/v, 1.6 mL)中反应得到11b(12 mg,27%). MS (ESI): m/z 1883 M + Na+ (100%). HRMS

38、 (ESI): m/zcalcd for C81H98BF2I2N13NaO19 M + Na+ 1882.5157, found1882.5101. 经HPLC分析其纯度为97%。细胞株和培养条件：KB(ATCC, no. CCL-17)和 MCF-7 (ATCC, no. HTB-22)细胞保养在RPMI1640(表达载体，no.23400-021)和小牛血清（10%），青霉素-链霉素(100 units mL1 和100 g mL1)中,在一个96-多孔盘上每孔1*104（KB）或2*104（MCF-7）细胞在含5%CO2湿润气氛中37孵化一夜。光细胞毒性检验：化合物11a和11b溶于D

39、MF制得1.9mM溶液，然后用吐温80稀释到80M.，再以游离叶酸RPMI1640（表达载体，no. 27016-021)稀释到各种浓度。吐温80溶液和培养基在有光和无光下均无细胞毒性。细胞用磷酸缓冲液（PBS）冲洗后，与100L这些二苯乙烯BODIPY溶液在375%CO2下培养24h。在室温光照前再用PBS冲洗，再加入100L培养液。光源系统由300W卤素灯，冷却水箱和一个610nm滤色玻璃（Newport）组成。光照强度( > 610 nm) 为40 mW cm2，20分钟总照明量为48 J cm2，光照后，细胞在375%CO2中培养过夜。细胞存活率是由MTT法测定的。42将MTT(

40、USB)的PBS(3 mg mL1, 50 L)溶液加入每个孔中，在相同环境中37下培养3h。然后每孔加入十二烷基硫酸钠溶液(USB,10%按重量计, 50 L)。将板置于烤箱6030分钟，然后各孔加入80L异丙醇。多孔板在Bio-Rad酶标仪上室温振荡10s后测量每孔在540nm的吸光度。空白孔的平均吸光度是由其他孔的读数相减得到的。细胞存活率就可以由以下方程得到：%存活率= (Ai/Acontrol) × 100/n,Ai是第i个井的吸光度，Acontrol是不含BODIPY孔的平均吸光度。显微荧光研究：在盖玻片上涂上2*105的KB或MCF-7细胞于培养基中，375%CO2中培

41、养过夜。取出后经PBS冲洗后，在11a和游离叶酸培养基(5.0 M, 2 mL)中培养24h，然后用PBS冲洗细胞，并用Olympus IX 70倒置显微镜观察。激发波长610nm是由多波照明灯(Polychrome IV, TILL Photonics)发射。发射的荧光是用MetaFluor V 6.3(通用成像)测定分析的，并可得到平均细胞内荧光强度(每个样本共计24为细胞)。对于11a和11b的细胞摄取研究，在于11a或11b和叶酸培养基(1.0 M, 2 mL)中培养24h后，用PBS冲洗细胞，用带有633nm氦氖激光器的Leica SP5聚焦显微镜观察。检测650-750nm的荧光，

42、图像用Leica荧光分析软件数据化分析。便可得到平均细胞内荧光强度(每个样本总计50细胞)。亚细胞定位研究：在盖玻片上涂上2*105的KB或MCF-7细胞于培养基中，375%CO2中培养过夜。取出后经PBS冲洗后，在11a或11b和游离叶酸培养基(1.0 M, 2 mL)中培养24h。在用Lyso-Tracker的研究中，细胞与Lyso-Tracker Green DND 26（分子探针，培养基中含量：4.0M）再培养15分钟。对用Mito-Tracker 和ER-Tracker的研究中，细胞与Mito-Tracker Green FM（分子探针，培养基中含量：0.2M）或ER-Tracker

43、 Green（分子探针，PBS中含量：1.0M）再培养15分钟。所有这些细胞都用PBS冲洗并以配备488nm和633nm激光灯的Leica SP5共焦显微镜观察。所有显色剂都被633nm波激发，并在650-800nm发射荧光。图像用Leica荧光分析软件数据化分析。11a和11b的亚细胞定位是通过分析该染料和Lyso-Tracker, Mito-Tracker,或ER-Tracker显色剂的细胞内荧光图像得出的。4.相关内容4.1辅助信息10，11a，11b的高效液相色谱图，11a，11b在DMF中的紫外可见色谱图，ZnPc，11a，11b在DMF中对DPBF的光降解速率比较，以及4a,4b,

44、5a,5b，7a,7b在CDCl3中的1H、13CNMR。这些材料可通过互联网免费获取：.4.2作者信息相关作者* D.K.P.N.: phone, +852-3943-6375; fax, +852-2603-5057;e-mail, .hk.* P.-C.L.: phone, +852-3943-1375; fax, +852-3943-1326;e-mail, .hk.注：作者声明没有经济利益竞争。4.3致谢本工作由中国香港中文大学资助(2009/10- 2010/11)。4.4使用的缩略短语BODIPY

45、, 氟硼二吡咯; DCC, N,N-二环己基碳二亚胺;DMF, N,N-二甲基甲酰胺; DMSO, 二甲亚砜;DPBF, 1,3-二苯基异苯并呋喃; ESI,电喷雾电离; PBS, 磷酸盐缓冲液; PDT, 光动力疗法; TFA, 三氟乙酸; THF,四氢呋喃; ZnPc, 锌酞菁; F, 荧光量子产率。5.参考文献(1) Garland, M. J.; Cassidy, C. M.; Woolfson, D.; Donnelly, R. F.Designing photosensitizers for photodynamic therapy: strategies,challenges a

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