黄曲霉毒素的研究进展

1、黄曲霉毒素的研究进展第26卷第18期2010年9月甘肃科技GansuScienceandTechnologyZ.26Sep.18201O黄曲霉毒素的研究进展吴兆蕃(甘肃省白银市产品质量监督检验所,甘肃白银730900)摘要:黄曲霉毒素(Aflatoxin,简称AF)是由某些真菌产毒菌株产生的次生代谢产物,具有极强的毒性,致癌性,在自然界中普遍存在.概述了黄曲霉毒素的毒性,理化性质,分布与产生的条件及对人体的危害.主要论述了黄曲霉毒素检测方法的研究进展并介绍了黄曲霉毒素的去除方法及预防措施,进而确保人类健康.关键词:黄曲霉毒素;毒性;检测方法;去除中图分类号:TS227食品安全是人们都极其关注的

2、,尤其是绿色食品和有机食品概念的提出更加增加人们对食品安全的关注.食品安全的影响因素很多,其中AF的危害是比较突出的一个问题¨J.黄曲霉毒素(Aflatoxin,简称AF)是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物,尤其AFB是目前发现的真菌类毒素中毒性最大,污染范围最广的毒素之一J.对它的研究是目前国内外关注的热点.在世界不同地区发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中,AF污染已导致严重的食品安全问题L3】.自20世纪6o年代以来,有关AF的危害被大量报道,以致AF已成为最受人们关注的一种真菌毒素.因此,寻求准确,快速,简便的检测方法J,对AF进行高效的定性定量的分

3、析,是AF研究的一个重要方面.1AF概况1960年首次于英国伦敦郊区火鸡x病的发生导致了AF的发现.AF是一类结构和理化性质相似的真菌次级代谢物,是自然界中已经发现的理化性质最稳定的一类霉菌毒素.1.1AF的毒性AF是一种剧毒物质,对人有极强的毒性,对肝脏有明显的损伤,可引起肝实质坏死,胆管上皮增生,肝脂肪浸润及肝出血等病变,AF是一类强致癌物质,能使人体或动物的免疫功能丧失,中毒症状表现为呕吐,厌食,发热,黄疽,腹水等肝炎症状,能诱导畸形,癌症的发生.常见的几种AF的毒性按大小顺序排列依次为B,M.,GB:和G.AF既有很强的急性毒性,也有明显的慢性毒性.AFB的急性毒性,见表1.慢性毒性主

4、要表现为动物生长障碍,肝脏出现亚急性或慢性损伤.世界各国均对食品中的AF的含量做出了严格的规定,我国与美国食品药物管理局(FDA)规定AFB标准是一致的,仅有欧盟对AF限量标准最为严格,1999年欧盟规定食品中的AF总量不得超过4pg/kg.表1AFBl的LD50(mg/kg.体重)1.2AF的理化性质黄曲霉尽管种类繁多-5j,但它们基本结构中都有二呋喃环和氧杂萘邻酮(又名香豆素),前者为其毒性结构,后者可能与其致癌有关.AF难溶于水,己烷,乙醚和石油醚,易溶于甲醇,乙醇,氯仿,乙腈和二甲基甲酰胺等有机溶剂,分子量为312346,熔点为200300.AF对光,热和酸稳定,耐高温,通常加热处理对

5、其破坏很小,只有在熔点温度下才发生分解.AF遇碱能迅速分解,pH为9一lO时迅速分解成几乎无毒的盐,但此反应可逆,即在酸性条件下有复原.因此在食品去毒时可利用这一化学反应.毒素纯品在高浓度下稳定,低浓度的纯毒素甘肃科技第26卷在紫外辐射易分解.5%的次氯酸钠溶液,C1:,NH”HO:及sO等均可与AF起化学反应破坏其毒性.在自然条件下,食品中污染的AF稳定性很强.AFB严重污染的稻谷,室温下自然存放已有20多年,毒性含量逐渐降低,但仍可检出AFB.AF是一类在紫外光的照射之下能发出强烈特殊荧光的物质.各种AF中,以B,B:,G和G:为主.B族和G族毒素的最大区别是,在紫外光照射下,13族毒素发

6、出蓝色荧光(波长为425nm),而G族毒素发出绿色荧光(波长为450nm.在紫外区域,各种毒素一般都表现出三个吸收高峰.在测定时,由于所用的溶剂不同,吸收高峰常略有不同,一般在222223nm,265nm和362363nm范围内.在红外区域,各种毒素也表现出凡个吸收高峰,各种AF的旋光性均为右旋.1.3AF的分布与产生的条件1.3.1AF的分布AF常常存在于土壤,动植物,各种坚果特别是花生和核桃中.在大豆,稻谷,玉米,通心粉,调味品,牛奶,食用油等制品中也经常发现AF.一般在热带和亚热带地区,食品中AF的检出率比较高.在中国总的分布情况为:华中,华南,华北产毒株多,产毒量也大,东北,西北地区较

7、少.1.3.2AF的产生AF的产生需要一定的条件,不同的菌株产毒能力差异很大,除基质以外,温度,湿度,空气均是AF生长繁殖及产毒的必要条件.研究者发现AF和寄生曲霉的最佳生长条件为3338qC,pH为5.0和Aw(水分活性)为0.99.温度在2428之间,相对湿度在80%以上,黄曲霉菌产毒量最高.故南方及温湿地区在春夏两季易发生AF中毒,有的作物甚至在收获前或收获期就可能被AF污染.1.4AF的危害AF污染引起食品变质.食品由于受其污染而食用价值降低,甚至完全不能食用,美国弗吉尼亚洲在5年时间内检测了500份玉米样品,每年的玉米样品中约有25%含有毒素.人类食用被AF污染的食品会导致急性中毒,

8、引起肝脏坏死出血,慢性中毒可引起肝癌.同时用被污染的饲料饲养畜禽会使畜禽生产率降低,增重减慢,间接对人类造成重大危害.1.4.1对人类健康的影响食品和饲料中AF的量在lmkg以上就有剧毒,其中Bl的毒性最强,是氰化钾的l0倍,砒霜的68倍.食用被AF污染的食品后,可出现发热,腹痛,呕吐,食欲减退,严重者在23周内出现肝脾肿大,肝区疼痛,皮肤黏膜黄染,腹水,下肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状,也可能出现心脏扩大,肺水肿,甚至痉挛,昏迷等症状.由于AF特别是Bl是潜在的致癌物质,人长期接触低剂量的AF可能会有影响.1988年国际癌症研究机构将AFB1列为I类致癌物质.在亚洲和非洲进行的许多流行性

9、病研究机构研究表明食物中AF的含量与肝细胞癌症呈正相关.1.4.2对经济的影响世界粮农组织(FAO)估计,25%的食用作物受真菌毒素的影响,其中主要是AF.AF可导致家畜死亡,生长率下降,饲料利用率降低.AF还能降低食用作物和纤维作物的产量.由于各国制定了相应的AF允许标准和法规,从而对贸易会造成一定的影响,如欧盟多次以AF超标为由拒绝进口花生及其制品.2AF检测方法的研究进展AF的检测方法从最初以薄层层析法为主,发展到高效液相色谱法,微柱法,酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用,其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分¨.这些新方法,新手段的快速应用,为黄曲霉毒素的检测提供了更广

10、泛的选择余地,适应了不同的检测目的和要求.2.1AF的检测方法2.1.1薄层层析法(TLC)薄层层析法是测定AF的经典方法,其博理是将样品经过提取,柱层析,洗脱,浓缩,薄篮分离后,在波长365nm紫外光下产上蓝紫色或黄绿色荧光,并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量.聂孝同等¨J应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的AF进行了检测.首先是AF的提取:把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中,加人甲醇(55:45)溶液,再加入石油醚盖严,静置片刻后,用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中,通人三氯甲烷,再过滤并将滤液在65C水浴上通风挥干,冷却后加入苯一乙腈(98:2)充分混合,然后吸取上清

11、液待用.对杂质少的样品,采取直板定性,依次点板,展开,观察;其中预展展开剂为无水乙醚,正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1:9),且展开剂要事先加入到展开槽内;通过观察,无荧光出现为阴性,出现荧光则为阳第l8期吴兆蕃:黄曲霉毒素的研究进展9l性,需作直板确证,若继续有荧光出现,则进一步作定量确证;样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致,则取此点为样本的AF含量值,否则作稀释定量检测;但是对于杂质多的样品,须采取横板定性;同样经过点板,展开,观察,有荧光者为阳性检出,进一步作横向确证,经再次检测观察呈阳性,则需要定量确证AF含量.为了提高薄层层析法的精度,建立薄层扫描法来测定AF,样品的处理和层

12、析条件与薄层层析法相同,只是在标准品的设定和结果判定上有所不同.杨焱等-1把粉碎过筛的样品加水湿润后通入氯仿过滤,取滤液在65水浴上挥干,再用苯一乙腈溶液转移;通过点板,用乙醚预展后,再用氯仿一丙酮(92:8)展开,在365nm紫外光下观察,根据AFB1,AFB2,AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色,蓝紫色,绿色和绿色荧光,在扫描仪上绘制AFr扫描图谱,并由此分辨出AF种类;最后作定量分析:以斑点面积积分值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,建立回归方程,得到样品的AF浓度.2.1.2高效液相色谱法(HPLC)HPLC具有高分辨率,分析时间较短等优点-】.它的原理是样品溶液中欲分离的几

13、种化合物在流动相和固定相之间有不同的分配量,从而达到分离的目的.AF经柱后电化学衍生化后,能发射特征性荧光,被荧光检测器捕获后而得到检测,最后经化学工作站处理数据u引.这一检测方法,将化学分析试验与领先的计算机技术结合,使自动化程度得到极大的提高,在试验空间,人力和仪器都保持不变的情况下,能检测更多的样品.HPLC是近几年发展起来的检测AFB.的方法,主要是用荧光检测器检测.该法快速而准确,但需要昂贵的仪器设备,未能广泛使用.宋欢报道了用高效液相色谱法测定饲料中AFB的方法.采用色谱柱,甲醇水(甲醇:水为3:7)为流动相,荧光检测器检测,激发波长365nm,发射波长455nrn.该法的平均回收

14、率为83%,变异系数为2.24%.2.1.3微柱法微柱法测定AF,是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附AF并在365nm紫外光下显示荧光,其强度与一定浓度的AF含量成正比关系,由此可简略定量AF.陈达民¨通过微柱法采用以下步骤测定AF:先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中,加入石油醚和甲醇溶液,给瓶塞上涂一层水,盖严防漏,放在振荡器上振荡;等静置分层后,用快速定性滤纸过滤,用移液管吸取甲醇溶液并加入氯仿,再静置分层,将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤,加人制好的微柱管中,待加液流至顶层时,加入氯仿一丙酮(9:1)展开剂展开,流完后即可在365nm紫外光下观察结果,有微黄色荧光出现,则样品不

15、含AF,若蓝紫色荧光出现,则为阳性检出,再根据其荧光强度与事先已知含量的AF标准管相比较确定其含量.2.1.4酶联免疫吸附法(ELISA)酶联免疫吸附法是抗原(或抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应,用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度,是一种定性或半定量的方法.大致采用两种方法检测AF:一种是用双抗体夹心法;另一种是用竞争法.免疫吸附法测定的试剂盒及配套仪器,方法被列入国家标准(GB/T5009221996第二法).Holladay等¨采取间接ELISA技术,检测了抗AFM1一牛血清白蛋白(Ab-rM1一BSA)免疫原的特异性AFF

16、M1抗体.为了使用方便,利用酶联免疫原理研制出AF快速测试盒,能简便地定量测定AF含量.赵晓联等应用这种快速测试盒测定AF含量,先用三氯甲烷提取样品,过滤,收集并水浴挥干提取液,再用甲醇溶解,最后用专用AF试剂盒测定.关于运用酶联免疫法检测AFTB1的检测报道也较多,目前国外已有较成熟的检测食品及饲料中AFrB1等真菌毒素的ELISA试剂盒出售,我国自2O世纪9O年代以来也有一些以ELISA检测食品及饲料中AFTB1的研究报道.如陈福生【2报道了酱油中AFrB1的ELISA检测,方法简便,快速,回收率在82%以上,与TLC法相比,ELISA法检出值更高.刘冬儿22报道了食品中AFTB,的ELI

17、SA测定,线性范围0.255.OOng/ml,检测灵敏度达0.O15g/kg,比薄层色谱提高了300400倍,回收率大于89.2%,精密度高,测定时间短,只需4h.2.1.5其他方法1)溴化荧光分光光度法(SFB)231样品经甲醇一水混合溶剂提取后,部分提取液通过固相分离进行柱前处理,500lxL纯化的提取液用溴试剂衍生化后,用荧光检测计中检测,样品荧光吸收度与硫酸喹啉液的吸收度比较可直接换算成AF的总含量.Vicam公司v2系列4型荧光光度计可直接读出AF含量,该法已通过AOAC和美国农92甘肃科技第26卷业部联邦谷物检测中心的认证.2)超光谱(HS)方法超光谱法是基于反射能基础上的一种非侵

18、入无破坏的映像技术,用于农产品检测中,能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节.Dav.idCasasent等尝试性地用它来检测玉米中AF含量,但它似乎能更好地用于霉菌识别.进一步地开发利用还有待于解决HS特征选择的最优化问题.另据研究报道,培训黄蜂可用于AF检测.由于AF主要是由黄曲霉产生的,寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来,并对这些气味产生有区别的行为反应,借此来识别目标气味的存在.这种培训反应正在应用于储藏玉米,花生的AF监控和检测实践当中,目前还未给出有关的结果评定.2.2检测方法的评价薄层层析法对样品处理繁琐,实验过程复杂,所需时间多,易受杂质于扰,较适合于对

19、AF的定性检测,是研究AF初期所使用的主要方法.今后,虽然薄层层析法在不断地改进,并在一般实验室均可完成操作,但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制.高效液相色谱法测定AF,技术水平要求较高,目前采用这种方法检测AF较多,但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大,对实验结果的精度造成影响,这种方法还应在实践中进一步改进.但总体上说高效液相色谱法操作较为简便,同时可检测多个AF种类,适于大批量样品的分析.将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用,是目前采用较多的一种方法,今后将被广泛应用.微柱法测定AF,主要是用来检验AF的存在与否以及快速筛选出超标样品,而要对AF种类

20、进行区分定量检验,则需要对不同AF组分进行分离,再利用其他方法检测.因此,微柱法并不能完成整个AF检测过程,仅适用于定性检验.酶联免疫吸附法操作简便,使用较为安全【2,但由于酶本身的不稳定性,用此方法检验AF有可能带来假阳,阴性结果,而且研制出的AF快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主,食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中AF的超标问题.酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高.溴化荧光分光光度法的最大优点是检测时不使用AF对照品,同时快速,灵敏,适合大批量样品普查,仪器价格也较低,张雪辉等比较了用SFB法和溴衍生HPLC检测中药中AF的结果,发现SFB法在测定中药时可能出现许多假阳性结果.A

21、F特有的极大危害性和广泛分布性,给检测提出了一系列问题.高效液相色谱法和酶联免疫吸附法在应用中仍需不断改进和完善.为分析AF提供方便和快捷的手段,达到及早预防和去除AF污染的目的,还应研制探索新的检测方法,显然,寻求快速,准确且经济可行的检测方法已成为AF研究中亟需解决的任务之一.3黄曲霉毒素的去除措施3.1物理方法3.1.1挑选霉粒,碾磨加工,反复搓洗黄曲霉素在食品中分布极不均匀,在花生样品中以霉变,破损,长芽,皱皮及变色花生粒最为集中,只要将其拣除,毒素含量将大大降低,甚至低到无毒.碾磨加工可将大部分集中于米糠层和谷皮,胚层的黄曲霉素去除一大部分;搓洗可去除粮食表面的大量毒素.3.1.2吸

22、附法常用的吸附剂有沸石,活性白陶土,活性碳等.含有AF的植物油可加活性白陶土或活性炭等吸附剂,毒素可被吸附而去毒,如广西用此法处理花生油,加入1.5%的白陶土,可使花生油中AF由原来的lO0g/kg降至lOng/kg.根据Phillips教授1998年在毒理科学上发表的研究结果显示,沸石粉及膨润土对AF几乎没有吸附效果.目前中国毒素吸附剂市场上的比较乱象,选择正确的霉菌吸附剂是控制霉菌毒素的根本保证.所以选择毒素吸附剂时,一方面应注意吸附能力必须具备试验室及动物试验双重资料方能证明有效,另方面考虑吸附剂具有高度吸附能力,选择性吸附,广谱吸附,无副作用等条件.3.1.3辐射处理AF在紫外光照射下

23、不稳定,可用紫外光照射去毒.该法去毒对植物油等液体食品效果较好,而对固体食品效果不明显.应用辐射法,必须注意照射的剂量和照射时间,以不影响食品的感官和理化性质为宜.3.2化学方法3.2.1碱处理法碱炼是油脂精炼的一种加工方法,在油脂中加人1%NaOH溶液,AF内酯环即可破坏,形成香豆素钠盐.后者可溶于水,故加碱后再用水洗可将毒素去除.加碱水洗可使油中AF降至标准以下,甚至第18期吴兆蕃:黄曲霉毒素的研究进展93不能检出.3.2.2有机溶剂萃取法AF为脂溶性毒素,易溶于有机溶剂,可用水合乙醇,异丙醇,丙酮,正己烷和水的混合物等进行提取分离,去毒.提取需反复35次,去毒效果可达90%以上,其中以丙

24、酮和水(90:100)混合液效果最好.处理后的粮油制品,必须将溶剂彻底挥干,方可食用.3.2.3氧化降解法漂白粉,氯气,双氧水,臭氧等氧化剂可以迅速将AF氧化去除,其中以漂白粉去毒效果最强.高度污染的花生粉可用5%漂白粉处理几秒钟就可以全部去毒,用氧化剂处理过的粮食经火鸡喂养试验证明无毒.3.2.4二氧化氯法霉变染有AFB1的玉米,用250la,g/mL低浓度的二氧化氯浸泡3060rain,能有效地解除AFB.的毒性.3.2.5中草药去毒法1976年我国首次发现山苍子中的挥发油可以彻底除去食品中的AF.挥发油中的某些成分与AF可发生加成和缩合反应,改变毒素分子结构,达到去毒目的.AF超过国家标

25、准2O倍的玉米,稻谷或超标2500倍的花生经大剂量山苍子芳香油处理可一举去毒.此法简便易行,特别适合家庭应用,并对食品质量和营养成分无任何影响.另外,甘草,葫芦巴,羽扁豆,茴香,五香粉,大蒜等也有去除AF的作用.3.3生物学方法乳酸菌粘附法是通过乳酸菌自身粘附作用和所分泌的代谢产物的抑菌作用,来去除AF.由乳酸菌产生的乳酸链球菌素具有粘附,降解AF的作用.乳酸菌广泛地应用在食品发酵工业中,具有改善肠道微生态,防腐和治疗功效.乳酸菌能分泌许多抗菌物质,阻止病原菌的生长.其他微生物如枯草杆菌,乳酸菌,醋酸菌等对AF降解能力最强,在液体培养基60h后,可分别除去89%,88%和81%.3.4酶解法酶

26、的降解去毒主要利用酶的专一性,高效地催化,降解AF为无毒化合物或小分子无毒物质的方法.酶降解去除黄曲霉素效果好,实用性强,适合于各种形式受到污染的食品,必将成为今后研究和应用的热点.4结束语AF是一种强致癌的天然毒素,直接威胁着人类的健康和生命,随着食品安全性知识的普及和消费者安全意识的加强,各国先后对食品中AF的允许量提出了严格要求.为了保障人类的健康,必须对AF污染的预防,控制和去除方法进行深入的研究,这就给农业技术工作者,检测工作者,科学工作者提出了更高的要求.参考文献:1史贤明食品安全与卫生M.北京:中国农业出版社,20032杨小兵.食品污染与食品安全控制J.湖北预防医学,2003,1

27、6(1):15-16.3潘葳,庞广昌.黄曲霉毒素与食品安全J.江西食品工业,2004(3):30-31.4王晶,王林,黄晓蓉.食品安全快速检测技术M.北京:化学工业出版社,2002:92102.5裘维蕃.菌物学大全M.北京:科学出版社,1998,723-735.6黄惠明,徐群英,胡敏.黄曲霉毒素检测方法研究的概述J.中国卫生检验,2001,11(4):510-512.7叶雪珠.黄曲霉毒素B1检测方法的分析J.食品与发酵工业,2003(10):90-92.8赵飞,焦彦朝,连宾,等.黄曲霉毒素检测方法的研究进展J.贵州农业科学,2006,34(5):123-126.9匡佩琳.中药黄曲霉毒素Bl的含

28、量测定J.中成药,2000,22(7):78-79.10GB/T5009.23.2oo3,食品中黄曲霉毒素Bl,B2,Gt,G2的测定s.11刘作新,高军侠.黄曲霉毒素的检测方法研究进展J.安徽农业大学学报,2004,31(2):223-226.12聂孝同,卢大云.饲料黄曲霉毒素的检测方法J.贵州畜牧兽医,1993,17(1):41-42.13杨焱,宓晓黎,成恒嵩,等.薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B.的含量J.饲料工业,1996,l7(10):36-37.14涂文升.高效液相色谱法同时检测食品中四种黄曲霉毒素J.中华预防医学,2002,36(5):343-345.15张丽,朱姝,张文海.高效

29、液相柱后衍生法测定食品中的黄曲霉素B.J.中国卫生检验,2006(1):7071.16宋欢.液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B.J.山西农业大学学报,2001,21(3):257-259.17柳洁,何碧英.高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究J.现代预防医学,2002,29(2):137-140(下转第84页)甘肃科技第26卷养出颗粒污泥;水力负荷过大,可能会导致污泥大量流失,导致运行失败.UASB反应器一般控制在0.10.3m?m一?h,可以较快地培养出颗粒污泥引.4UASB反应器运行常见异常情况4.1酸败UASB运行中如进料量增大或进料浓度增大,导致进料负荷过高,超过UASB反应器

30、的承受能力,反应器内水解菌和产酸菌增多,反应器内pH降低,产甲烷菌受到抑制,导致出水pH下降,出水COD上升,称为”酸败”.要防止反应器发生”酸败”,及早发现是最关键的.由于产气量的变化比较及时且明显,若发现反应器产气量突然降低,就应引起重视,对各个指标认真观察,判定是否发生”酸败”.若出水pH已下降到5.0左右,应立即停止进料,向反应器内补充石灰或纯碱,将出水pH调到7.0,稳定几天后再重新进料.刚进料由启动负荷进料量开始,负荷提高可以稍快,随时观测各控制指标,以“宁缓勿冒”为原则.若有恶化迹象可适当延长恢复时间,当负荷达到酸败前上一级水平时,在此负荷下运行较长时间,一般应在一个月左右,经监测各指标正常后再决定是否增加进料负荷.4.2污泥流失造成污泥流失的原因很多,如进料量过大,水力负荷过高,温度突变,pH突变,及有毒物质冲击等.跑泥的实质是操作条件的变化使已形成的颗粒污泥性状发生变化,如污泥带气性增强,污泥密度减小,污泥颗粒变小等,造成颗粒污泥沉降性降低而发