20S人参皂苷Rh2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响

1、20_S_人参皂苷Rh_2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响李秋影 炎璐璐 马晓慧 张莉华 张兰兰 郭治昕（1. 天津中医药大学，天津300193；2. 天津天士力研究院药理毒理所，天津3004410）摘要：目的 研究20（S）-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao-2和HT-29细胞增殖及周期的影响。方法 采用荧光微孔法测定20（s）-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao-2、HT-29细胞增殖的影响：利用显微镜观察给药后HT-29细胞形态变化：流式细胞术分析20（s）-人参皂苷Rh2对HT-29细胞周期分布的影响。结果 20（S）-人参皂苷Rh2对Caco-2、HT-29细胞生长有抑制作用，并呈剂

2、量依赖性：20（S）-人参皂苷Rh2作用48h后，对HT-29、Caco-2细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为19.68、26.79g/ml；流式细胞分析结果现实，与对照组细胞相比，20（S）-人参皂苷Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加D期细胞比例。结论 20（S）-人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞增殖，主要原因是阻滞细胞处于S期关键词： 20（S）-人参皂苷Rh2：HT-29：Caco-2：细胞增殖：细胞周期中图分类号：R996 文献标识码：A 文章编号：1001-1528（2001）11-1874-05人身为五加科人参属植物人参Panax ginsen

3、g C.A.meyer的干燥根，是已有几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明，人参中包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性。人参皂苷Rh2作为人参中一类主要生物活性成分，在癌症的治疗方面具有较强的活性，其中一人参皂苷-Rg3为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市。大量研究表明，人参皂苷Rh2也同样具有较好的抗癌活性，如通过抑制端粒酶活性从而诱导肝癌SMMC-7721细胞分化、通过介导细胞内Caspase一类半肽氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2细胞的增殖并诱导凋亡以及逆

4、转耐药的白血病细胞等。药代动力学研究表明，人参皂苷-Rh2主要在肝、胃肠道分布；并通过线粒体途径包括P53、CASP5等多靶点诱导结肠癌SW480细胞凋亡，国内也有文献初步报道人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞株SW620和LOVO生长。从结构上，人参皂苷Rh2可分为S型和R型的构象，其中20（S）-人参皂苷Rh2单体（20（S）-G-Rh2）是植物中分离的主要构型。但20（S）-G-Rh2单体对人结肠癌细胞Ht-29和Caco-2的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20（S）-G-Rh2对人结肠癌Caco-2和Ht-29细胞增殖及对周期的影响，以期为新药研发和临床治疗结肠癌提供理论依据。1 材

5、料和仪器20（s）-G-Rh2（天津天士力药物研究院现代中药研究所，纯度为90%）：DMEM培养基（GIBCO-BRL公司）；胎牛血清（G1BCO-BRL公司）；二乙酸荧光素Flourescein Diacetate,FDA（Sigma）；Cell Cy-cle Phase Determination Kit（Cayman Chemical Com-pany）；流失细胞仪FACSCcalibur（Bechman Dickson公司）；Caco-2、HT-29细胞由西河医科大学基础医学细胞中心引进，由本实验室传代培养；2 方法2.1 细胞培养于传代 将HT-29和Caco-2细胞至于37，饱和湿

6、度5%CO2培养箱中常规培养，均用含10%热灭活胎牛血清，1%的抗生素（青霉素100mg/L和链霉素100mg/;）的DMEM完全培养基。细胞呈单层生长，达80%左右融合时，采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1：1）混合消化液（胰酶）消化传代，取生长对数期的细胞用于实验。2.2 荧光微孔法监测细胞增殖实验 将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。接种于96孔培养板中，每孔接种100L，于37，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后换液，空白对照组为DMEM培养基，实验组每孔加入50-12.

7、5g/mL5个浓度的20（2）-G-Rh2（用DMEM培养基配置）处理48h，每个浓度组及对照组君左3个平行孔。48h后吸弃板中培养基，加入100L含2.5g/mL二乙酸荧光素的PBS重复洗2变，甩去PBS并吸弃板中剩余的PBS，Leica DM16000B 电动倒置荧光相对显微镜在激发和发射波长分别为488nm和530nm下，测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，并求算出半数抑制浓度（IC50），实验重复3次。细胞生长抑制率%=（1-给药组荧光强度/对照组荧光强度）×100%2.3 显微镜观察细胞形态学变化将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶

8、消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔2mL细胞悬液细胞悬液种于放置盖玻片的6孔板中，培养细胞爬片生长。培养24h，带细胞在盖玻片上贴壁良好后，加入0.2mL20g/mL20（S）-G-Rh2处理细胞48h，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。2.4 流式细胞仪检测细胞周期 将对数生长期的HT-29细胞，用胰酶混合消化液消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 个/mL。接种于6孔培养板中，每孔接种2mL，于37，饱和湿度为5%CO2培养箱中，每孔接种2mL，于37 ，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后，换无血清的DM

9、EM培养液同步化24h，加不同浓度的20（S）-G-Rh2处理细胞24h，加不同浓度的20（S）-G-Rh2处理细胞24h后，经胰酶（不加EDTA）消化，Assaybuffer洗2遍，（3000rpm，3min），加入固定液固定2h，上机前离心弃去固定液，加入100mg/LR-Nase和5g/L碘化丙啶（PI）染色剂，染色避光30min，流式细胞仪检测细胞周期变化。2.5 统计学处理用SPSS10.0软件完成统计学处理，软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差即（±S）表示，组间分析比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。3. 结果 3.1 20（S）-G

10、-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖的影响 二乙酸荧光素（FDA）可透过细胞膜并脱脂释放荧光素积累在活细胞中，激发和发射波长分别为488nm和530nm，常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA为荧光指标剂建立了微孔板法进行20（S）-G-Rh2对人结肠癌细胞Caco-2和HT-29的增殖影响研究。结果显示，20-（S）-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度而增强，呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29和Caco-2细胞的半数抑制率（IC50）分别为19.68g/mL和25.79g/mL。（结果如表1，图1、2）。3.2 显微镜观察细胞形

11、态学变化 20g/mL 20（S）-G-Rh2处理48h后的HT-29细胞较空白对照组细胞成群贴壁生长、细胞透亮，折光性好。而给药组细胞之间互相脱离，颜色加深，贴壁细胞数量减少，细胞轮廓消失。（见图3）。3.3 20（S）-G-Rh2对HT29细胞周期的影响20（S）-G-Rh2处理24h后细胞，用流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞数。结果显示;20g/mL 20（S）-Gh2处理24h后HT-29细胞在细胞周期的分布发生娴熟性的变化。对照组G0/G1期、G2/M期、G2/M期、S期细胞比例分别为（76.78±4.0）%、（3.61±2.1）%和（19.60±3.5

12、9）%、（0.8±1.21）%及（54.54±2.17）%：给药组20（S）-G-Rh2的G0/G1期和G2/M期细胞比例明显的减少，S期细胞比例升高，与对照组有显著性差异（P<0.05），具有统计学意义，（建表2，图4）。4 讨论结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，临床主要以手术治疗并术后放疗和化疗为主要治疗手段，但对晚期效果不佳。人参皂苷是人参的主要生物活性成分，人参皂苷单体中G-Rh2具有抑癌活性，并对正常组织毒性甚低。目前体内外实验结果表明：通过对细胞周期的影响，诱导细胞凋亡，从而时间和剂量依赖性的抑制多种多种肿瘤细胞的增殖。但20（S）-人参皂苷Rh2对人结直肠

13、癌细胞Caco-2和HT-29的研究还未见到报道,因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞，考察20（S）-G-Rh2对人结肠癌细胞的凋亡及细胞周期的影响做初步的探究。本研究结果表明，20（S）-G-Rh2可抑制人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞生长，且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性，其IC50分别为19.68和26.79g/mL。显微镜下现实：当一定剂量的20（S）-G-Rh2作用48h后的人结肠癌细胞HT-29出现明显的细胞死亡形态。肿瘤的发生是一个多步骤、多因素、多阶段改变的过程，其中细胞周期调控失控被认为是肿瘤发生的重要机制。细胞凋亡可发生在细胞周期的各个时相。采用流式细胞分析技术进行细胞周期研究，结果显示：20（S）-G-Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加S期细胞比例，说明20（S）-G-Rh2可阻滞人结肠癌细胞HT-29于S期。与-拉帕醌阻滞结肠癌细胞SW480、SE620和DLD-1于S期进而导致凋亡的机制相同。综上所述，2