酶促反应动力学实验

1、酶动力学综合实验实验一一一碱性磷酸酶值的测定【目的要求】1. 了解底物浓度对酶促反响速度的影响2. 了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其屮以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌屮提取的。2、米氏方程：在研究底物浓度与酶促反响速度的定量关系时，导出了酶促反响动力学的根本公式，即：V二卩机0卅S1K池十式屮：V表示酶促反响速度，也丈表示酶促反响最大速度，S表示底物浓度，心表示米氏常数。3、心值的测定主要采用图解法，有以下四种： 双曲线作图法

2、图 1-1, a根据公式1，以v对s作图，此时1/2$人时的底物浓度s值即 为值，以克分子浓度W表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条 件下的底物浓度很难使酶到达饱和。实测是一个近似值，因而1/21A不准确。此外由于v对S的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易 绘制。 作图法双倒数作图法图 1-1, b实际工作屮，常将米氏方程式 1作数学变换，使之成为直 线形 式，测定要方便、准确得多。其中之一即取 1 式的倒数 , 变换为方程 式：丄=旦* 丄+亠v Vmax S Vmax2以決堆 1 作图，即为形式。此时斜率为怦，纵截距为产。把直线 U U VE*VEX外推与横轴相交，其截距相交，其

3、截距即为一亡。 作图法略把2式等号两边乘以Vmax，得：輕 V+1Km*max3)以V对着作图，这时斜率为-心，纵截距叽,横截距为-兽AJ作图法(略)把(2)式等号两边乘以S以旦对s作图，这时斜率为宀，纵截距为严。I? V mar(b)本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物， 碱性磷酸 酶能分解 磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下(10.0,和60°C),准确反响13分 钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色 化合物，以波长620比色。在 一定条件下色泽深浅与光密度成正 比。反响式如下:9OH 霸试剂磷孵酸蓝色化

4、合物然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反响速度， 即以光密度的倒数 作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按作图法来 测定碱性磷酸酶值。【仪器与试剂】仪器：1 ?恒温水浴2. 721型分光光度计试剂：1. 酚试剂：称鹤酸钠"亦血吃禺。100g,钳酸钠血血吃弘。25g置1500磨口回流装置内，加蒸憎水 700, 85%磷酸50和 浓硫酸100。 充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h 烧瓶内加小玻璃珠数颗， 以防溶液溢出，再参加硫酸锂 4150g,蒸馆水50及液澳数滴。在通风橱中开口煮沸 15,以除 去多余的 澳。冷却后定容至1000,过滤即成，此液应为鲜黄 色，不带任何绿色。 置

5、棕瓶中，可在冰箱长期保存。假设此 贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液漠，煮沸几分 钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用 蒸憎水稀释一倍，最 后酸度为INO2. 2. 5磷酸苯二钠基质液:称取625磷酸苯二钠C6H542? 2H20,溶于1,000容量瓶屮，加蒸馅水稀释至刻度，加数滴夜漠以防腐，置冰箱内可保存一年之久。3.3. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1加水3、4,冰箱内可保存 五周左右。【实验步骤】取6支试管按下表参加试剂1234562.5磷酸苯二钠00.20.40.60.81.01.0蒸憾水00.80.60.40.2-0碱性缓冲液01.01.01.01.01.01.0混匀后，60&#

6、176; C欲温5分钟碱性磷酸酶液0.10.100.10-混匀后，60 C水浴1注意：1参加碱性磷酸 酶沼2此时为酶促犬3第六管3分钟帥 要快速、 乏响，总体 "不加酶。亍确计时隹确。用移液枪加积2酚试剂01.01.01.01.01.01.01023()3.03.03.03.03.03.0混匀后，室滥 注意：1酚试剂为显色剂，|5 剂后酶促反223提供碱性环境，丄放置15分钟时为酶的变性剂，故参加酚试响即停顿。参加23后试剂才显色以6管为调零点，在620波长处比色【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表管号1SI1/S123452以1为纵坐标，l/s为横坐标，按作图，求出碱性磷酸

7、酶的值【本卷须知】1) 参加碱性磷酸酶的量要准确2) 保温时间要准确准确保温的方法：从第一管参加酶液开场计时，每隔 1 分钟向 下一只试 管加酶液，直至加完，到准确 13 分钟立即向第一管加酚 试剂，以终止其 反响，并每隔 1 分钟向下一只试管加酚试剂，直 至加完止，这样保证每 管准确保温 13 分钟。【思考题】1) 的意义及其影响因子2) 为什么酶促反响速度以初速度表示3) 为什么可直接代替 V 作图4) 分析自己的实验数据实验(二)一一温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认【实验原理】i般而每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。

8、言，假设酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失 ；而假设处于极低温度的环境屮只会使酶活性受到抑制，一旦温度，酶又会全部或局部的恢复其活性。【仪器与试剂】仪器：1.冰箱管和试管架4.吸量管及吸量管架头滴管7烧杯试剂：2.恒温水浴锅5.移液枪及枪头3试6.胶3. 0. 03175 碘液5. 1M溶液6.稀释100倍4. 1M溶液的唾液7.冰水浴【实验步骤】1. 制管和预温由于本实验对恒温反响要求较高，故每个温度梯度使用两支 试管,分别标记为A管和B管，同时欲温底物与酶取12支干净试管，参照下表参加试剂：7/157 / 15管号1 (0 °)2 室温3(37 ° C)4(50

9、9)5(70 °C)6 室温A6.8的缓冲 液222222含的0. 5%淀粉液22222用2的蒸 憾水代替B稀释100倍的唾液111111*6号管为对照组比色时作为 0号管，置于室温，且淀粉液用蒸憎水代替2. 混合A、B管将1号A管试剂迅速参加温度对应的 B管中为了最大限度 保证 酶的量，此时为计时的起点使用秒表，摇匀后放回对应 温度继续 水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。3. 时间控制然后每隔1或2时间自定按上步操作依次把 2、3、4、5、6号的A、B管混合，严格控制好时间。4. 中止反响准确反响13,向1号管参加2滴1M溶液，立即混匀，屮止 反响, 按上一步的顺序和时间间隔依

10、次对各管进展操作，并移至 试管架。后再 各用2滴1M溶液屮和每管。5. 显色在每管中各参加2 0.03175碘液并混匀，观察现象6. 比色假设不同温度梯度间现象差异不明显，那么进展比色，通过光密度值来比较。【结果处理】 记录现象或比较吸光度值，做出合理分析。【本卷须知】严格注意时间的控制及各物质的添加量。【思考题】 如果某同学没有严格按照教案步骤做出的实验结果为唾液淀 粉酶的 最适温度为 70 度，请分析他得出这样的结果的可能原因。实验三对酶活性的影响【实验目的】 了解对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】1 对酶活性影响的机理：影响酶活性中心的某些必须基团的解离，而这

11、些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或 具有最大催化 活性；影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态， 从而影响酶对他们的 亲和力；还可以影响酶活性屮心的空间构象 , 从而影响酶的活性。2. 本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受的影响的情况。 淀粉 在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的 水解，从而得 到各种糊精乃至麦芽糖，少量葡萄糖等水解产物。碘 液与淀粉及其不同 程度的水解产物反响呈现不同颜色，即淀粉9 / 159 / 15 蓝色、紫色糊精紫色、红色糊精红色、麦芽糖及少量葡萄 糖 黄色。【仪器与试剂】仪器：1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管5、移液管架及移液

12、管试剂：1、 0. 2M磷酸氢二钠溶液：称取35. 61g含2个结晶水的磷酸 氢二 钠，用水定容至 1L。2、 0. 1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定 容至 lLo3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 10 倍、 50 倍和 100 倍，得 三种不 同浓度的酶液、5、0.1%淀粉液：0. lg可溶性淀粉，加到100蒸憾水中，加 热溶解。6、碘液： 15g 碘化钾和 12. 7g 碘，加少许水使碘完全溶解后 , 再用水稀释至 200。7、1%氯化钠溶液。8、0. 1%硫酸铜溶液。【实验步骤】一对酶活性的影响表1磷酸1编号和加试剂：2操作:1、缓冲溶液的配制配制取六只干净的三

13、角烧瓶，按表 取六支干净试管，编号后按表三角烧瓶号123456值5.46.26.87.07.48.00.2M磷酸二氢钠 011.1513.2215.4516.4718.1719.450.1 M柠檬酸08.856.784.553.531.830.55表2对酶活性的影响管号123456值5.46.26.87.07.48.0缓冲液量333333含的0.5%淀粉0222222稀释100倍唾液0222222充分摇匀，37° C水浴保温，严格控制时间5后，立即向各管参加碘液碘液滴333333充分摇匀，观察各管颜色差异【结果处理】记录现象或比较吸光度值，做出合理分析【本卷须知】 充分摇匀，严格控制

14、时间思考题】酶的最适值受哪些因素影响 ?实验四一一酶浓度对酶活性的影响的认识。速度随而且酶的同一适【实验目的】 了解酶浓度对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性【实验原理】在适宜的条件下，假设反响物浓度大大高于酶浓度时，反响 酶浓度增加而增加，两者间成正比。但假设反响底物浓度 较低 浓度足够高时，增加酶浓度，反响速度根本不变。本实验采用唾液淀粉酶为例。参加不同浓度的酶，并比较在 当时间后，以碘检验淀粉的含量从而确认其反响程度。【仪器与试剂】仪器：1 ? 恒温水浴锅2. 吸量管3. 试管与试管架试剂：1. 含的 0.5%淀粉液2.7. 0的缓冲液3.分别稀释过10倍、50倍和100倍后的唾液

15、【实验步骤】1.取3支干净试管，按下表参加淀粉液，缓冲液，加毕放入37度恒温水浴锅屮保温5分钟；2.保温后，快速参加不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入37度恒温水浴屮，并计时。约 3至4分钟后参加等量碘液一至 两滴，立 即摇匀后，记录各管的颜色。管号含的0.5%淀粉液7.0的缓冲液稀释唾液颜色10倍50倍100倍132123213321【结果处理】记录现象，做出合理分析【思考题】实验五离子对酶活性的影响【实验目的】了解离子对酶活性及酶促反响速度的影响，加深对酶特性的认识【实验原理】酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增 加，称 为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑 制剂。是唾液淀 粉酶的激活剂。其它的阴离子，女口、和对该酶 也有激活作用，但较微 弱。而貉对唾液淀粉酶具有抑制作用。激 活剂和抑制剂影响酶活性的剂量 是很少的，并且常具有特异性。就本实验，低浓度可以增加酶活性，高浓度的或者低浓度的 那么会 抑制酶活性，同时低浓度的、产等对酶活性没有影响。 激活剂的作用机制是多种多样的， 可能是作为辅酶或辅基的一个 组成局部， 也可以直接作为酶活性屮心