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文档简介
1、雌激素受体( ER) 免疫组化试剂盒该试剂盒以 HRP 标记的链霉亲和素复合物( HRP Streptavidin Conjugate , HRP-SA)为基础,可用于检测细胞、组织内的特异性雌激素受体( ER)抗原。该 试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的雌激素受 体(ER)一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,最后加入 HRP-SA,形成抗原特异一抗生物素化二抗 HRP-SA 复合物,显微镜下观察 成像。试剂盒所含试剂:试剂 A 通透液: 0.1% Triton-X 100 10 mL (选用)试剂 B 2 瓶封闭缓冲液(封闭用) 10 mL/ 瓶
2、试剂 C (原装进口分装)已稀释的即用型雌激素受体( ER)一抗( 2.5ml )试剂 D (原装进口分装)生物素化羊抗兔 IgG 1 支(浓度 1.5 mg/mL,稀释比为 1:3001:500 )50 L+抗体稀释液 20ml试剂 E HRP-SA复 合物 1 支(浓度 1 M,稀释比 1:501:200 )100 L 试剂 F DAB 显色液 5ml用户自备试剂: 雌激素受体( ER)1 10mM TBS(pH7.27.4 )三羟基氨基甲烷 1.21g 氯化钠 7.6g加蒸馏水 800mL,浓盐酸调 pH 值至 7.27.4 ,最后定容至 1000mLTBS-T:TBS+Tween 20
3、(0.05%体积比) 2抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液) 10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液 柠檬酸 0.38g 柠檬酸三钠 2.45g 加蒸馏水 900mL,浓盐酸调 pH 值至 6.0 ,最后定容至 1000mL 或: 0.5M EDTA修 复液( pH8.0)EDTA2H2O 186.1g 雌激素受体( ER) 柠檬酸三钠 2.45g加蒸馏水 700mL,用 10mM NaO调H pH 值至 8.0 ,最后定容至 1000Ml3. 缓冲甘油封固剂 10 mL4. Tween 20 5 mL石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤(建议方案):石蜡包埋组织切片 34m 厚度1. 烤片
4、: 将待做切片置于切片架上,于 60恒温烤箱中至少烤 1 hr ;2. 脱蜡: 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡 3 次(即二甲苯、),每次10 min ;3. 水化: 切片经下行酒精水化, 无水乙醇 5min,95%乙醇2 次(每次 2min),85% 乙醇 2 min ;75%乙醇 2min,自来水冲洗, ddH2O洗 2 2min;4. 抗原修复: 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温 度达到 98100)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗, ddH2O洗 2 2min,TBS 洗涤( 22min)(具体修复方法见附 1)* 注:有些抗原勿需修复, 直接进入第 5
5、 步封闭。5. 封闭: 滴加试剂 B,37湿盒孵育 30 min;6. 加一抗:滴加用试剂 C(即用型一抗),37湿盒孵育 2 hr 或 4过夜;7. 洗涤: TBS-T 洗涤( 35 min );雌激素受体( ER)8. 封闭: 滴加试剂 B,37湿盒孵育 10 min;9. 加二抗: 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂 D),37湿盒中孵育30 min ;10. 洗涤: TBS-T 洗涤( 35 min );11. 封闭: 滴加试剂 Tween 20,37湿盒孵育封闭 20 min;12. 加 HRP-SA: 滴加用试剂 C 稀释的试剂 E(1:50200,终浓度 520 nM),3
6、7 湿盒中孵育 30 min ;13. 洗涤: TBS-T 洗涤( 35 min ),TBS洗 涤(25 min);14. 显色:应用 DAB溶 液(试剂 F)显色;15. 复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;16. 封片: 待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片;17. 观察成像: 显微镜下观察成像。注意事项:1. 修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷有可能导致 结晶或抗原封闭。2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液不能反复使 用。3. 若试剂为微量浓缩液, 用前应低速离心, 将内盖和管壁附着的溶液离到底部。4. 封片前一定要换用 TBS充
7、分洗涤,以便洗去组织上残留的 Tween 20,否则会 影响结果观察。5. 如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封 片。附 1 : 抗原修复方法常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液( 0.01M pH6.0 )、EDTA 抗原修复液( pH8.0 或 9.0 )等等。一、酶消化修复法切片脱蜡水化处理, TBS 冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶, 37孵育 2030min 后 TBS冲 洗即可。二、微波抗原修复法微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾, 将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料 切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或高档继续微波 1015min ,取出微波 盒冷却至室温后, 自来水冲洗,取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异, 须自行调整。三、直接高压抗原修复法取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾, 将组织切片置于耐高温切片架上, 修复 液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时 1.52.5min 即可脱离热源,自 然冷却至室温后自来水冲洗, 取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。四、隔水式高压抗原修复法 雌激素受体( ER)不锈钢高
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