脂肪干细胞的提取及鉴定(1)

1、红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是 疑问的地方，希望老师解答下 谢谢一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、 实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后 ACSs的表 型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化） ，差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中， 基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最 终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL/6 WT小鼠2 只, 常规麻醉

2、消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%11型胶原酶消化（37C, 30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶 的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过 200目铜网， 得到单个核细胞。镜下计数，按10"个细胞/ml种植在培养瓶中，37T 5%CO2孵 箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细 胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C

3、D29/CD44）的鉴定。2、实验用品：2.1 材料：C57BL/6 WT 小鼠2.2试剂：PBS液，0.075%11型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒臵显微镜、离心机、 离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。（前两周重点学习）3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。b. 取材：取C57BL/6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，

4、取腹股沟脂肪组织剪碎至 糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中，加入胶原酶（0.075%11型胶原酶，PH）, 用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，臵于 37T水浴或恒 温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的 消化。d. 离心 和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min? 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨 溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min?离心10分 钟（先后顺序

5、），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数 结果调整细胞浓度为10"个细胞/ml。e. 接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液， 盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒臵相差显微镜下观察细胞分散情况后， 臵于37C 5%CO2孵箱培养。322观察每天对接种培养的细胞做常规性检查。观察的主要内容：污染与否、细胞生 长状态和pH （培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为 柠檬黄色有浑浊， 表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。 如培养液颜色变为 紫色，可 能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。如 培养

6、液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的 细胞延展成短梭状），24小时后第一次换液，以后3天换液一次（细胞生长旺 盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，变色时 是否即可换液？）。培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞 形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，（80%融合后）可进行传代培养。3.3细胞传代培养3.3.1操作步骤a. 取一瓶脂肪干细胞在倒臵相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层， 即可进行传代。b. 将培养瓶带

7、人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取 2ml-3ml PBS加入培养瓶 中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。c. 加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层， 臵于室温下笑话2-3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上 出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1-2mi n。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下 一步操作。d. 加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取样计数， 调整细胞浓度为1

8、0&个细胞/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留 下1ml细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中？）， 并向每瓶中加4ml培养液。盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒臵相差显微 镜下观察细胞分散情况后，臵于 37C 5%CO2孵箱培养。3.3.2观察细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况 消化传代。此过程中所做处理同原代培养。 注意观察细胞五个时期的特点（游离 期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。3.4再次传代同上4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪

9、作细胞周期及细胞免疫 表型（CD29/CD44）的鉴定4.1在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较（原代培养后，传代2-3次，ACSs 呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在 25-30um，待细胞达到汇合时，它们形 态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞）4.2细胞周期分析分别取生长融合达30%-40%和90%以上的第三代细胞，以4° C预冷的70%冰 乙醇固定，4° C放臵24小时；用PBS洗涤2次；加入RNA酶10ug和碘化丙 啶（PI） 0.3ml重悬细胞（4° C，30分钟）。用流式细胞仪以FL2红色荧光条件 检测。应用Modfit LT 2.0软件分析细胞周期。

10、，取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定（用细胞表面分子免疫标记方法？所用抗体？）。4.2细胞表面分子免疫标记的鉴定a方法：直接免疫荧光法b.试剂及材料：单克隆抗体CD29 PE，CD44 PE及同型对照抗体；细胞洗液： 含 2%BSA、0.1%NaN3 的 PBS;固定液：1%多聚甲醛 PBS 液（pH7.2）; 4、流 式细胞仪。c .操作方法：每个样品取2只，分别标记同型抗体作为阴性对照、 待测，分别加入106个/100ul 待测细胞。对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体CD29、CD44对照抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29

11、PE，CD44 PE为实验管， 各20ul，混匀。臵于于室温避光孵育 30分钟，加入2ml的PBS，1200r/min离 心10min,弃上清，控干，加入固定液 0.5ml （染色缓冲剂）。先测同型对照， 再测实验管。软件采集数据，分析阳性细胞比例。二、携带PTN表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定1、 实验技术及原理：运用基因转染技术，将带PTN基因的反转录病毒载体（PIRES2-LEGFPN1由加州大学洛杉矶分校Cedars-Si nai医学中心心内科赠送）转染到脂肪干细胞，抗生素 G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪 干细胞。2、具体操作：2.1材料及试剂：2.2脂肪干细胞的准备

12、：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接 决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用 胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的 60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也 需在转染前4小时换一次新鲜培养液。2.3将带PTN基因的反转录病毒载体转染（感染？）到脂肪干细胞， 带有PTN 基因混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边 轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。2.4用抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到 PTN高表达的脂肪干细胞G418筛选要做预试验确定最佳浓度

13、，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等1 2 个级别,培养 10-14 天，以最低细胞 全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持 使用筛选浓度的一半（筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？ 维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？）流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3单细胞悬液 f 70%酒精固定f裂解细胞f核糖核酸

14、酶消化f碘化丙啶染色f上机分析G1期 和G2/M、S期比例。2.3小鼠后肢慢性缺血模型的建立C57BL/6 WT小鼠66只流式检测管，分别加入扎左侧股动脉及肉眼可见的分 支血管、远端及其主要分支，切口消毒缝合。术后第1周，2周及第4周分别对后肢缺血损伤进行半定量评估（0分：没有改变；1分：轻度肤色改变；2分：中 到重度肤色改变；3分：坏死；4分：自发截肢）。1、 细胞死活和生长活力的判断？主要看其生长形态和是否贴壁生长？2、取第三代细胞，主要是因为扩增需要？还是原代培养是是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，细胞生长分裂到一定成度后就需要更大成长空间和营养物质， 所以就要传代培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则 细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物 不足和代谢物