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文档简介

1、红色的是参考同类实验所用的方法,比例,不知道在我们实验室可行不,黄色是 疑问的地方,希望老师解答下 谢谢一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、 实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后 ACSs的表 型会发生改变,主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化) ,差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离,沉淀中除ASCs,还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞,基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中, 基质细胞可贴壁,造血和其他杂质细胞不贴壁,在随后的传代过程中被出去,最 终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL/6 WT小鼠2 只, 常规麻醉

2、消毒,取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状,PBS液冲洗去麻药及血液,0.075%11型胶原酶消化(37C, 30分钟)以去除外基质,生理盐水终止胶原酶 的消化,离心(1200g,10分钟),去上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀,0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞,离心洗涤,过 200目铜网, 得到单个核细胞。镜下计数,按10"个细胞/ml种植在培养瓶中,37T 5%CO2孵 箱培养,24小时后第一次换液,以后3天换液一次,80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细 胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(C

3、D29/CD44)的鉴定。2、实验用品:2.1 材料:C57BL/6 WT 小鼠2.2试剂:PBS液,0.075%11型胶原酶消化,10%FBS,低糖DMEM2.3仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒臵显微镜、离心机、 离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯,200目铜网过滤器,低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。(前两周重点学习)3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a培养用品消毒后,安防在超净工作台内,紫外线消毒,做好洗手等准备工作。b. 取材:取C57BL/6 WT小鼠2只,常规麻醉消毒,

4、取腹股沟脂肪组织剪碎至 糊状,PBS液冲洗去麻药及血液。c. 消化:将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶(0.075%11型胶原酶,PH), 用量(0.1-0.3ug/ml或200U/ml),再用移液管移至烧瓶中,臵于 37T水浴或恒 温箱中30分钟),每隔5-10min振荡一次。30min后,生理盐水终止胶原酶的 消化。d. 离心 和计数:将离心管做好标记,平衡后以(1200g,1200r/min? 10分钟),去上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀,0.16mol/L氯化氨 溶解剩余红细胞,将收集的细胞悬液经200目铜网过滤,1200r/min?离心10分 钟(先后顺序

5、),得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数 结果调整细胞浓度为10"个细胞/ml。e. 接种培养:每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液,再添加4ml的培养液, 盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期,在倒臵相差显微镜下观察细胞分散情况后, 臵于37C 5%CO2孵箱培养。322观察每天对接种培养的细胞做常规性检查。观察的主要内容:污染与否、细胞生 长状态和pH (培养液颜色变化)等情况。如发现培养液变为 柠檬黄色有浑浊, 表明已被污染,细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。 如培养液颜色变为 紫色,可 能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气,CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。如 培养

6、液为橘红色,一般说明细胞生长状态良好。在没有发生污染,接种24h后,可见到许多细胞贴壁(由圆形悬浮状态的 细胞延展成短梭状),24小时后第一次换液,以后3天换液一次(细胞生长旺 盛,代谢产物堆积,CO2增多,培养液逐渐变酸呈黄色,但液体澄清,变色时 是否即可换液?)。培养3-4天时,细胞生长繁殖,细胞数量增加,并可见细胞 形成孤立小片(细胞岛),逐渐扩展,细胞透明,颗粒啥,界线清晰。7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层,(80%融合后)可进行传代培养。3.3细胞传代培养3.3.1操作步骤a. 取一瓶脂肪干细胞在倒臵相差显微镜下观察,培养细胞如长成致密的单层, 即可进行传代。b. 将培养瓶带

7、人超净工作台,倒去细胞培养液,吸取 2ml-3ml PBS加入培养瓶 中,轻轻振荡后倾去,可重复进行一次。c. 加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA,转动培养瓶,使其湿润整个细胞层, 臵于室温下笑话2-3min。翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层,见细胞单层薄膜上 出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1-2mi n。如见细胞大片脱落,表明已消化过头,则不能倒去消化液而直接进行下 一步操作。d. 加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层,直至瓶壁上的细胞全被冲下,再轻轻吹打混匀,制成单细胞悬液。取样计数, 调整细胞浓度为1

8、0&个细胞/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中,原瓶留 下1ml细胞悬液,弃去多余悬液(可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中?), 并向每瓶中加4ml培养液。盖好瓶盖,标上名称、组号和日期,在倒臵相差显微 镜下观察细胞分散情况后,臵于 37C 5%CO2孵箱培养。3.3.2观察细胞传代后,每天对细胞进行观察,注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况 消化传代。此过程中所做处理同原代培养。 注意观察细胞五个时期的特点(游离 期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期)。细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层,这时可进行再次传代培养。3.4再次传代同上4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪

9、作细胞周期及细胞免疫 表型(CD29/CD44)的鉴定4.1在细胞镜下作形态学观察,与正常形态比较(原代培养后,传代2-3次,ACSs 呈现单层,大而扁的细胞形态,其直径在 25-30um,待细胞达到汇合时,它们形 态上呈纺锤形,类似于成纤维细胞)4.2细胞周期分析分别取生长融合达30%-40%和90%以上的第三代细胞,以4° C预冷的70%冰 乙醇固定,4° C放臵24小时;用PBS洗涤2次;加入RNA酶10ug和碘化丙 啶(PI) 0.3ml重悬细胞(4° C,30分钟)。用流式细胞仪以FL2红色荧光条件 检测。应用Modfit LT 2.0软件分析细胞周期。

10、,取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定(用细胞表面分子免疫标记方法?所用抗体?)。4.2细胞表面分子免疫标记的鉴定a方法:直接免疫荧光法b.试剂及材料:单克隆抗体CD29 PE,CD44 PE及同型对照抗体;细胞洗液: 含 2%BSA、0.1%NaN3 的 PBS;固定液:1%多聚甲醛 PBS 液(pH7.2); 4、流 式细胞仪。c .操作方法:每个样品取2只,分别标记同型抗体作为阴性对照、 待测,分别加入106个/100ul 待测细胞。对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体CD29、CD44对照抗体作为阴性对照,待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29

11、PE,CD44 PE为实验管, 各20ul,混匀。臵于于室温避光孵育 30分钟,加入2ml的PBS,1200r/min离 心10min,弃上清,控干,加入固定液 0.5ml (染色缓冲剂)。先测同型对照, 再测实验管。软件采集数据,分析阳性细胞比例。二、携带PTN表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定1、 实验技术及原理:运用基因转染技术,将带PTN基因的反转录病毒载体(PIRES2-LEGFPN1由加州大学洛杉矶分校Cedars-Si nai医学中心心内科赠送)转染到脂肪干细胞,抗生素 G418和流式细胞仪筛选,得到PTN高表达的脂肪 干细胞。2、具体操作:2.1材料及试剂:2.2脂肪干细胞的准备

12、:被用于作靶基因转染的细胞,其生长状态如何,将直接 决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用 胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,细胞密度以铺满培养器皿的 60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞,也 需在转染前4小时换一次新鲜培养液。2.3将带PTN基因的反转录病毒载体转染(感染?)到脂肪干细胞, 带有PTN 基因混合物应当逐滴加入,尽可能保持一致,从培养皿一边到另一边,边加入边 轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。2.4用抗生素G418和流式细胞仪筛选,得到 PTN高表达的脂肪干细胞G418筛选要做预试验确定最佳浓度

13、,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等1 2 个级别,培养 10-14 天,以最低细胞 全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持 使用筛选浓度的一半(筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定? 维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?)流式细胞仪分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3单细胞悬液 f 70%酒精固定f裂解细胞f核糖核酸

14、酶消化f碘化丙啶染色f上机分析G1期 和G2/M、S期比例。2.3小鼠后肢慢性缺血模型的建立C57BL/6 WT小鼠66只流式检测管,分别加入扎左侧股动脉及肉眼可见的分 支血管、远端及其主要分支,切口消毒缝合。术后第1周,2周及第4周分别对后肢缺血损伤进行半定量评估(0分:没有改变;1分:轻度肤色改变;2分:中 到重度肤色改变;3分:坏死;4分:自发截肢)。1、 细胞死活和生长活力的判断?主要看其生长形态和是否贴壁生长?2、取第三代细胞,主要是因为扩增需要?还是原代培养是是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养,细胞生长分裂到一定成度后就需要更大成长空间和营养物质, 所以就要传代培养,当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则 细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物 不足和代谢物

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