GB∕T 40977-2021 家用洗衣机 降低微生物污染测试方法

ICS97.060

CCSY62

中华人民共和国国家标准

GB/T40977—2021

家用洗衣机降低微生物污染测试方法

Clotheswashingmachinesforhouseholduse—Methodformeasuring

themicrobialcontaminationreduction

(IECPAS62958:2015,MOD)

2021-11-26发布

2022-06-01实施

隱蠢惠霞O霊籌餐2H

GB/T40977—2021

目次

tuW n

i翻 i

2规范性引用文件 1

3术语、定义和符号 1

3.1术语和定义 1

3.2 2

4 2

5试验条件、物质、设备和仪器 2

5.1试验条件 2

5.2材料和试剂 2

5.3 6

6i式马金 7

6.1试验原理 7

6.2待测洗衣机的准备 8

6.3试验微生物和含菌试验样块的准备 8

6.4主试验 9

6.5有效性 10

7利介 10

7.1对数减少值 10

7.2交叉污染 10

8试验报告 11

附录A（资料性）内部研发使用危险等级1级的微生物测试家用洗衣机中微生物的减少 12

附录B（资料性）材料和供应商信息 18

参考t献 19

图A.1系列稀释液的制备过程 16

表1 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）成分 3

表2 沙氏葡萄糖琼脂（含氯霉素）的成分 3

表3溴棕三甲铵琼脂/溴化十六烷基三甲铵琼脂的成分 4

表4 Baird-parker琼月旨的成分 4

表5 麦芽浸粉琼脂（MEA）的成分 4

表6 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的成分 5

表7 稀释液的成分 5

GB/T40977—2021

表8中和剂的成分 5

表9温度传感器的具体要求 7

表A.1沙氏葡萄糖琼脂的成分 13

表A.2哥伦比亚CAN琼脂的成分 13

11

GB/T40977—2021

本文件按照GB/T1.1—2020（（标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件修改采用IECPAS62958:2015（（家用洗衣机降低微生物污染测试方法》，文件类型由ISO的可公开提供规范调整为我国的国家标准。

本文件与IECPAS62958=2015的技术性差异及其原因如下：

一删除了国际标准第2章中EN1276、EN1650和EN12353三个规范性引用文件，因相关技术内容已在标准文本中；

一删除了国际标准6.3.1和A.5.3.1中EN12353.该段修改为“试验用微生物和相应的保藏菌种应按照以下要求制备和保存”；

一删除了国际标准6.3.1.2和A.5.3.1.2标题中“依据EN1650”，标题修改为“酵母菌悬液（白色念珠菌）的制备”；

一删除了国际标准6.3.1.4标题中“依据EN1276”，标题修改为“细菌悬液（恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的制备”。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国轻工业联合会提出。

本文件由全国家用电器标准化技术委员会（SAC/TC46）归口。

本文件起草单位：中国家用电器研究院、合肥美的洗衣机有限公司、万源众享联盟科技（北京）有限公司、青岛海尔洗衣机有限公司、博西华电器（江苏）有限公司、珠海格力电器股份有限公司、海信（山东）冰箱有限公司、国家家用电器质量监督检验中心。

本文件主要起草人：李一、熊明、姚艳春、时妍玲、蔡丽莉、刘常昱、朱国生、李珊珊。

111

GB/T40977—2021

家用洗衣机降低微生物污染测试方法

1范围

本文件规定了一种测试洗衣机降低微生物污染和减少无菌载体交叉污染的试验方法。

注：洗衣机降低微生物污染一个显著的差异是洗涤温度不超过4()°C。

本文件适用于带有或不带有加热装置、进水为冷水和/或热水的家用洗衣机，也适用于正常使用不加洗涤剂的洗衣机。同样适用于在社区、公寓或者自助洗衣店公用的洗衣机。

本文件不适用于商业用途的洗衣机，以及餐饮领域、医院或者其他非家庭使用的洗衣机。同样不包括需要特殊消毒处理或者消毒技术的人群使用的洗衣机。

本文件不涉及安全要求，也不包含IEC60456:2010中要求的洗衣机相关性能或者对织物的影响等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

ISO2267表面活性剂洗涤效果的评价未污染棉对照布的制备和使用方法(Surfaceactiveagents—Evaluationofcertaineffectsoflaundering—Methodsofpreparationanduseofunsoiledcottoncontrolcloth)

IEC60456:2010家用洗衣机性能测试方法(Clotheswashingmachinesforhouseholduse—Methodsformeasuringtheperformance)

3术语、定义和符号

3.1术语和定义

下述术语和定义适用于本文件。

3.1.1

洗衣机washingmachine

对织物进行洗涤和漂洗的器具，也可具有脱水功能。

3.1.2

测试洗衣机testwashingmachine

符合本文件部分或全部要求的用于测试相关性能的洗衣机。

3.1.3

试验循环testrun

单次性能测试。

3.1.4

程序programme

洗衣机内部预先设置好的，制造商声称的适合洗涤某种特定类型织物的一系列操作。

GB/T40977—2021

3.1.5

基本负载baseload

用于测试的织物负载，不包含含菌试验样块。

3.1.6

交叉污染crosscontamination

在一次试验循环中，微生物在织物之间的转移。

3.1.7

接种物inoculum

在培养基中培养的大量细菌。

3.1.8

含菌试验样块biomonitor

接种微生物的载体，用于测试微生物数量的减少。

3.1.9

温度曲线temperatureprofile

时间与温度的曲线，代表了测试循环洗衣机中水的温度。

3.2符号

下列符号适用于本文件。

log（Nn/N）：对数减少值

Nn:试验前2个阳性对照微生物数量的平均值（CFU/块）

N:试验后5个含菌试验样块微生物数量的平均值（CFU/块）

SDilliti!ll:No的标准偏差

SDWilslletl:N的标准偏差

SDtotal:对数减少值的标准偏差

V-1:10倍稀释液中微生物的数量

V-S100倍稀释液中微生物的数量

4要求

本文件规定了一种测试洗衣机降低微生物污染和减少无菌载体交叉污染的试验方法。本文件不涉及安全要求，也不包含IEC60456:2010中要求的洗衣机相关性能或者对织物的影响等。

5试验条件、物质、设备和仪器

5.1试验条件

试验环境（供电、供水、环境温湿度）的所有要求和负载见IEC60456=2010。

另外，测试试验用水中含有的微生物不超过100CFU/mL。5.2.1中所列的试验用微生物不应出现在试验用水中。

试验用水中微生物的数量按照5.2.3.2和6.5.3进行。

5.2材料和试剂

5.2.1试验用微生物

试验采用下列微生物，其中前两个为细菌，最后一个为酵母菌：

——恶臭假单胞菌（ATCC11172/DSM6521）；

——金黄色葡萄球菌（ATCC6538/DSM799）；

——白色念珠菌（ATCC10231/DSM1386）O

注：也可使用其他微生物。为了内部研发或者预评估洗衣机的除菌功能，附录A提供了一种使用危险等级为1级的微生物进行测试的方法。

5.2.2培养基和溶液

5.2.2.1培养基

所有的培养基和溶液都应是微生物用级别，使用前应使用合适的方法进行灭菌。宜使用商品化或者脱水的干燥培养基，下面的章条详细阐述了脱水培养基。

5.2.2.1.1胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）的成分见表1。

表1胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）成分

成分

含量

酪蛋白胨（胰酶消化物）CaseinpeptoneCpancreaticdigest）

15.0g/L

大豆蛋白胨（木瓜酶消化物）SoypeptoneCpapaicdigest）

5.0g/L

氯化衲Sodiumchloride

5.0g/L

琼脂Agar

15.0g/L

最终pH值

7.3士0.2

5.2.2.1.2沙氏葡萄糖琼脂（含氯霉素）（SDA）

沙氏葡萄糖琼脂（含氯霉素）的成分见表2。

表2沙氏葡萄糖琼脂（含氯霉素）的成分

成分

含量

酪蛋白胰酶消化物Pancreaticdigestofcasein

5.0g/L

动物组织的胃消化物Pepticdigestofanimaltissue

5.0g/L

葡萄糖Dextrosemonohydrate

40.0g/L

氯霉素Chloramphenicol

0.05g/L

琼脂Agar

15.0g/L

最终pH值

5.6±0.2

5.2.2.1.3溴棕三甲铵琼脂/溴化十六烷基三甲铵琼脂的成分

溴棕三甲铵琼脂/溴化十六烷基三甲铵琼脂的成分见表3。

表3溴棕三甲铵琼脂/溴化十六烷基三甲铵琼脂的成分

成分

含量

明胶胰酶水解物Pancreaticdigestofgelatine

20.0g/L

氯化镑Magnesiumchloride

1.4g/L

硫酸钟Potassiumsulphate

10.0g/L

丙三醇Glycerine

10.0g/L

西曲溴鞍Cetrimide

0.2g/L

琼脂Agar

14.0g/L

最终pH值

7.1±0.2

5.2.2.1.4Baird-parker琼脂

Baird-parker琼脂的成分见表4。

表4Baird-parker琼脂的成分

成分

含量

酪蛋白膝（胰酶消化）CaseinpeptoneCpancreaticdigest）

10.0g/L

牛肉膏Beefextract

5.0g/L

酵母膏Yeastextract

1.0g/L

氯化锤Lithiumchloride

5.0g/L

甘氨酸Glycine

12.0g/L

丙酮酸衲Sodiumpyruvate

10.0g/L

琼脂Agar

20.0g/L

亚硫酸納Sodiumtellurite

0.1g/L

卵黄乳液Eggyolkemulsion

50.0g/L

最终pH值

6.8±0.2

5.2.2.1.5麦芽浸粉琼脂(MEA)

麦芽浸粉琼脂(MEA)的成分见表5。

表5麦芽浸粉琼脂(MEA)的成分

成分

含量

麦芽提取物Maltextract

30.0g/L

大豆蛋白胨(用大豆中的木瓜蛋白酶消化)Soy-peptone，whichisdigestedwithpapainfromsoybeans

3.0g/L

琼脂Agar

15.0g/L

最终pH值

5.6+0.2

5.2.2.1.6胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的成分见表6。

表6胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的成分

成分

含量

胰蛋白藤，酵素消化的酪蛋白Tryptone,pancreaticdigestofcasein

17.0g/L

大豆蛋白胨，木瓜蛋白酶消化的大豆粉Soypeptone,papaicdigestofsoybeanmeal

3.0g/L

氯化衲Sodiumchloride

5.0g/L

磷酸氢二钾Dipotassiumhygrogenphosphate

2.5g/L

葡萄糖Glucose

2.5g/L

最终pH值

7.3±0.2

5.2.2.2培养基和溶液用水

重蒸水或去离子水都可以使用，但是去离子水使用前应进行灭菌。5.2.2.3稀释液

稀释液的成分见表7。

表7稀释液的成分

成分

含量

胰蛋白胨，酵素消化的酪蛋白Tryptone,pancreaticdigestofcasein

l.og/L

氯化衲Sodiumchloride

8.5g/L

吐温80Polysorbate80

0.05%

最终pH值

7.0±0.2

5.2.2.4 中和剂

微生物的生长需要合适的培养基和中和剂。

一种宜采用的中和剂的成分见表8O

表8中和剂的成分

成分

含量

吐温80Polysorbate80

30.0g/L

卵磷脂Lecithine

3.0g/L

组氨酸L-histidine

1.0g/L

硫代硫酸納Natriumthiosulohate

5.0g/L

在保证不影响最终结果的前提下也可以使用其他的中和剂。5.2.3洗涤剂

5.2.3.1

概述

使用IEC60456=2010中IECA*洗涤剂基粉。

5.2.3.2

用水量预试验

需要进行预试验确定用水量，以此计算洗涤剂的用量。预试验条件应满足以下内容。

a)

b)

c)

d)

e)

运行待测程序3次。

使用与主试验中相同量的负载。3次试验均使用干的基本负载（“基本负载”符合IEC60456=2010的要求）。

每公斤基本负载使用2g洗涤剂。

洗涤剂应放在洗衣机的洗涤剂槽中。如果没有洗涤剂槽，按照制造商的说明放置洗涤剂，如果没有说明，所有的洗涤剂加人洗衣机的内桶底部。

洗涤剂会降低表面张力，从而影响浸泡效果。

f)

计算3次平行试验主洗的平均用水量。主洗用水量依据IEC60456=2010进行试验。

5.2.3.3

主洗洗涤剂用量

洗涤剂用量按照主洗用水量2g/L进行添加。

如果有洗涤剂槽，洗涤剂槽上应标明为放置洗涤剂处。

如果没有洗涤剂槽，应按照制造商的说明放置洗涤剂，如果没有说明，所有的洗涤剂加人洗衣机的内桶底部。

5.3设备

5.3.1概述

除非另有说明，测试条件、材料、设备、仪器应与IEC60456=2010保持一致，操作要符合微生物实验操作规程。

5.3.2培养箱

培养细菌的培养箱应能保持温度在（36±r）°c，酵母菌应能保持在（3o±r）°c。

5.3.3灭菌锅

灭菌锅应能对设备及相关用品在121°C~1241条件下进行至少15min或者134°C~137°C条件下至少5min的饱和蒸汽灭菌。

5.3.4微生物载体

微生物载体是用ISO2267中的标准棉织物制作的样块，尺寸为1.0cmXl.Ocm。

样块在使用前应在蒸馏水中煮3次，灭菌，室温下干燥并保持无菌。

5.3.5移液器

移液器的标注容量应在0.1mL〜10.0mL。

19

5.3.6电子混匀器

实验室常用的电子混匀器可用于本文件，适宜的商业产品的例子参见附录B。

5.3.7离心机、离心管

离心机应能在使用50mL离心管室温条件下提供2000g的相对离心力。

5.3.8基本负载

基本负载应包含IEC60456:2010中列出的棉质基本负载。预处理的要求和所需质量的负载含有的种类和数量应按照该标准的要求。

基本负载使用次数应不超过80次。不要求符合IEC60456:2010附录J的要求。

每次试验前，基本负载应在不加洗涤剂的条件下洗涤，以去除残留的洗涤剂，然后应用90°C的水处理10min，干燥后保存在适宜条件下避免再次污染。

5.3.9温度变化测试设备

应使用温度传感器对温度变化进行测量，温度传感器应放置在负载中并追踪整个洗涤过程。温度传感器应符合表9中的要求。

表9温度传感器的具体要求

项目

指标要求

温度范围

00C〜100°C

精度

C0.5°C（覆盖整个测量范围）

分辨率

<0.1°C

反应时间TC（10%~90%）——水

^2min

反应时间TC（10%~90%）——流动空气（2m/s）

^5min

采样速率

<10s

最大重量

70g

注：TC（10%〜90%）是传感器达到其最终值的10%和90%时所需要的时间。反应时间也可以被表达为TC63%的值。63%的图是传感器达到其最终值63%所需要的时间。对于一个给定的传感器，TC（10%〜90%）和TC63%的值基本上在一个数量级。

5.3.10用水量测试设备

用水量测试设备应符合IEC60456:2010中5.5的要求。

6试验

6.1试验原理

含菌试验样块用于测定家用洗衣过程中微生物的减少和可能存在的微生物交叉污染。除非另有说明，试验条件，材料，设备和仪器应符合IEC60456=2010的要求。

6.2待测洗衣机的准备

每次试验前，待测样机应用851或90°C的程序进行预处理。

如果样机没有上述程序，应直接在洗衣机中加人不少于50L的，温度不低于90°C的水，运行2个测试程序。

之后应运行2个冷水漂洗周期以冷却洗衣机。

注：可以通过合适的方法监控样机的卫生状况，比如用接触平板。

6.3试验微生物和含菌试验样块的准备

6.3.1培养物

试验用微生物和相应的保藏菌种应按照以下要求制备和保存。

6.3.1.1白色念珠菌工作培养物

保藏菌种应在MEA平板上至少划线传代2次，获得白色念珠菌的工作培养物。

第一代培养物在（30+l）°C条件下培养42h〜48h后，以同样的方式转接第二代培养物并培养，第二代培养物用于制备含菌试验样块。

按照同样的方式从第二代培养物上制备第三代培养物，第三代培养物用于有效性分析（见6.5）。不制备第四代培养物。

如果在某些特定时间里不能制备二代培养物，且培养物在培养箱里培养时间没超过72h，可以用72h的培养物进行后续传代。这种情况下，在进行下一步试验前，应再制备48h的培养物。

6.3.1.2酵母菌悬液（白色念珠菌）的制备

按照以下步骤制备菌悬液。

a） 取10mL稀释液（见5.2.2.3）置于100mL三角瓶中，在工作培养物（见6.3.1.1）上刮取一环菌苔，置于稀释液（见5.2.2.3）中，在浸人稀释液之前，将接种环在三角瓶湿润内壁上刮擦使菌苔浸人稀释液。在振荡装置（见5.3.6）上振荡3min。

b） 使用稀释液调整菌悬液浓度在1.5X10sCFU/mL〜5.0X10sCFU/mL,通过适当的方式预估菌液浓度。将该菌悬液保存在4°C下，2h内使用。

注：宜优先根据分光光度计620nm处的吸光度值来调整菌液浓度（使用10mm比色皿），每个实验室宜做一个相关性数据，会发现吸光度在3.000-3.500之间时是合适的。为了获得可重复性的实验结果，有必要对菌悬液进行稀释，例如，10倍稀释。色度计也是一个合适的选择。

o为了方便计数，试验用菌悬液应用稀释液稀释至i（r6和i（r7稀释度。

每个样品的每个稀释度吸取1mL使用倾注平板或者涂布平板法培养，做两个平行。使用倾注平板法时，将1mL样品加人培养皿中，在培养皿中加人融化冷却至（45±1）°C的SDA。

使用涂布平板法时，将1mL样品均匀滴加到凝固的SDA平板表面，至少做两个平行。

6.3.1.3恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌工作培养物的制备

保藏菌种在TSA平板上至少划线传代两次，获得恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌的工作培养物。第一代培养物在（36+l）°C条件下培养24h后，以同样的方式转接第二代培养物并培养，第二代培养物用于制备含菌试验样块。

按照同样的方式从第二代培养物上制备第三代培养物，第三代培养物用于有效性分析（见6.5）。不制备第四代培养物。

如果在某些特定时间里不能制备二代培养物，假如培养物在培养箱里培养时间没超过48h，可以用48h的培养物进行后续传代。这种情况下，在进行下一步试验前，应再制备24h的培养物。

6.3.1.4细菌悬液（恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的制备

按照以下步骤制备菌悬液。

a） 取10mL稀释液（见5.2.2.3）置于100mL三角瓶中，在工作培养物（见6.3.1.3）上刮取一环菌苔，置于稀释液中，在浸人稀释液之前，将接种环在三角瓶湿润内壁上刮擦使菌苔浸人稀释液。在振荡装置（见5.3.6）上振荡3min。

b） 使用稀释液调整菌悬液浓度在1.5X109CFU/mL〜5.0X109CFU/mL（见5.2.2.3）。通过适当的方式预估菌液浓度。将该菌悬液保存在4°C下，2h内使用。

注：宜优先根据分光光度计620nm处的吸光度值來调整菌液浓度（使用10mm比色皿），每个实验室宜做一个相关性数据，会发现吸光度在0.200〜0.350之间时是合适的。为了获得可重复性的实验结果，有必要对菌悬液进行稀释，例如.10倍稀释。色度计也是一个合适的选择。

C）为了方便计算，试验用菌悬液应用稀释液稀释至i（r7和1（T8稀释度。

每个样品的每个稀释度吸取1mL使用倾注平板或者涂布平板法培养，做两个平行。使用倾注平板法时，将1mL样品加人培养皿中，在培养皿中加人融化冷却至（45±1）°C的TSA。

使用涂布平板法时，将1mL样品均匀滴加到凝固的TSA平板表面，至少做两个平行。

6.3.2含菌试验样块

6.3.2.1微生物载体

微生物载体要求见5.3.4。

6.3.2.2载体的接种

每个菌种每次试验使用5个微生物载体。

微生物载体浸人试验用微生物菌悬液中，用无菌镊子夹着反复旋转，使载体完全浸湿并除去所有气泡。

微生物载体应在菌悬液中放置20min〜30min，然后用镊子转移至开盖培养皿中，置于培养箱中至少干燥3h。细菌干燥温度为（36±1）°C，酵母菌干燥温度为（30±l）°C。

注：为了保证干燥3h后的效果，有必要确保培养箱内部的最小湿度。

每个接种的载体用无菌镊子分别转移至袋子中，每种微生物的5个载体应放置在5个棉袋中。另外，每种微生物两个接种的载体应用于有效性试验（见6.5）。

含菌试验样块放置在有盖培养皿中，置于室温下保存，干燥后一周内使用。

6.4主试验

6.4.1概述

根据制造商的说明选择主测试程序和试验负载的规格。

将干燥的负载平均分为两份，将其中一份放人洗衣机内桶中，将含菌试验样块（见6.3.2.2）和数据采集器放置在中间，然后放人另一半负载。不必按照IEC60456=2010的方法装载。

运行测试程序，按照6.4.2分析含菌试验样块。

每个测试程序至少进行3次试验。

6.4.2试验微生物的回收

测试程序结束之后，为了确定含菌试验样块上微生物的数量，将每个含菌试验样块置于10mL中和剂（见5.2.2.4）中，用电子混匀器（见5.3.6）混合均匀，然后涂布平板。

6.4.2.1微生物平板

稀释液应做两个平行。

为了准备系列稀释液，应使用无菌枪头，从最高稀释度开始，枪头在该溶液中冲洗3次，然后吸取0.1mL用涂布棒旋转涂布在合适的培养基平板上，涂布每个平板使用无菌涂布棒。

选取适宜的稀释度做平板计数（每个平板15CFU-300CFU）。

为了进一步区分，有必要在5.2.2中的选择性培养基上进行再培养。

6.5有效性

6.5.1试验之前微生物数量（阳性对照）

每次试验，每种微生物的含菌试验样块，在试验前应进行微生物计数。含菌试验样块上微生物数量的计数按照6.4.2进行。两个含菌试验样块微生物数量经过计算的平均值（loglO）是计算试验后见7.1）含菌试验样块微生物减少值的基础。

6.5.2阴性对照（交叉污染）

为了测定交叉污染，5个灭菌的微生物载体应进行一个6.4.1中含菌试验样块一样的过程。测试程序运行结束之后，上述加人的无菌载体上微生物的数量用6.4.2中描述的方法确定。每种微生物载体的选择性条件不同，对于每一种微生物载体应选择合适的培养基平板（见5.2.2）。

6.5.3水质的确定

为了确保水质的微生物含量，取洗涤过程中的1mL水样，用相关的培养基进行分析（见5.2.2），分别用涂布或者倾注平板法，培养条件如上文所述。

6.5.4主洗水量的确定

测试程序每次测试的主洗水量应按照IEC60456=2010的方法进行测试。

对于每一个试验循环，主试验中主洗水量与5.2.3.2中测试的用水量的差别不应超过±15%。

7评价

7.1对数减少值

每种微生物每个试验循环中减少的对数值按照如下方式计算：每种微生物减少的对数值=log（Nn/N）

式中：

Nn——阳性对照微生物数量的平均值（见6.5.1）；

N——试验后，5个含菌试验样块上微生物数量的平均值。

标准偏差应根据至少3次试验的NU、N和对数减少值进行计算。

7.2交叉污染

对照无菌样块培养一段时间之后，如果有任何微生物的生长应以CFU/无菌微生物载体的形式

声明。

如果没有生长，应表明小于100CFU/无菌微生物载体。

8试验报告

试验报告应包含下述信息：

•试验日期；

•根据IEC60456=2010确定的洗衣机类型；

•试验程序；

•负载质量（kg）;

•环境条件：电压、环境温湿度；

・使用的试验微生物；

・含菌试验样块的干燥时间；

・试验前每种微生物含菌试验样块上的数量；

・试验后每种微生物含菌试验样块上的数量；

・每种微生物的减少值（包含标准偏差）；

•无菌载体上微生物的转移；

・试验中水温变化曲线；

・含菌试验样块的产品数据（对于商品化的含菌试验样块：货号，生产数据，质量控制日期）。试验报告可以含有额外的信息，例如，依据IEC60456=2010确定的参数：•用电量；

・用水量（总用水量、主洗用水量、漂洗用水量）；

・程序时间；

・进水温度；

・生物控制样块的使用时间/使用前生物控制样块的干燥时间。

附录A

(资料性)

内部研发使用危险等级1级的微生物测试家用洗衣机中微生物的减少

A.1概述

本试验方法允许使用危险等级1级的微生物用于预评估或者内部研发。

洗衣机最终的降低微生物污染性能应按照本文件中的方法进行。

A.2总体建议

虽然本方法采用的危险等级1级的微生物不是病原菌，相关操作还是需要受过无菌操作专业培训的人员进行。盲目的操作可能会影响试验结果甚至造成结果的偏离。

允许危险等级1级的微生物有少量意外的溢出或者丢弃，但试验室宜将琼脂平板和缓冲液等高压灭菌处理后再丢弃或者处理。

清洗的液体可不经过无菌处理，直接排放。

A.3材料和试剂

A.3.1含菌试验样块采用的微生物

试验采用下述微生物，前两种为细菌，后一种为酵母菌：

•荧光假单胞菌(ATCC17397/DSM50091)；

•阿尔莱特葡萄球菌(ATCC43957/DSM20672)；

•酿酒酵母(ATCC9763/DSM1333)o

注：对于含菌试验样块可供选择的供应商，参见附录B。

A.3.2培养基和溶液用水

见5.2.2.2。

A.3.3培养基和溶液

A.3.3.1胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)

见5.2.2.1.1。

A.3.3.2沙氏葡萄糖琼脂

沙氏葡萄糖琼脂的成分见表A.1。

表A.l沙氏葡萄糖琼脂的成分

成分

含量

酪蛋白胰酶消化物Pancreaticdigestofcasein

5.0g/L

动物组织的胃消化物Pepticdigestofanimaltissue

5.0g/L

—^水合葡萄糖Dextrosemonohydrate

40.0g/L

琼脂Agar

12.0g/L

最终pH值

5.6±0.2

A.3.3.3沙氏葡萄糖琼脂（含氯霉素）

见5.2.2.1.2。

A.3.3.4溴棕三甲铵琼脂/溴化十六烷基三甲铵琼脂

见5.2.2.1.3。

A.3.3.5Baird-parker琼脂

见5.2.2.1.4。

A.3.3.6麦芽浸膏琼脂（MEA）

见5.2.2.1.5。

A.3.3.7哥伦比亚CAN琼脂的成分

哥伦比亚CAN琼脂的成分见表A.2。

表A.2哥伦比亚CAN琼脂的成分

成分

含量

胰酶消化的酪蛋白Pancreaticdigestofcasein

5.0g/L

胃蛋白酶消化的动物组织Pepticdigestofanimaltissue

8.0g/L

酵母富集蛋白膝Yeastentichedpeptone

10.0g/L

玉米淀粉Cornstarch

1.0g/L

氯化衲Sodiumchloride

5.0g/L

粘菌素Colistin

0.015g/L

蔡陡酸Nalidixicacid

0.01g/L

琼脂Agar

14.0g/L

脱纤维羊血Defibrinatedsheepblood

5%

最终pH值

5.6±0.2

A.3.3.8胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）

见5.2.2.1.6o

A.3.3.9稀释液

见5.2.2.3。

A.3.3.10中和剂

见5.2.2.4。

A.3.4洗涤剂

见5.2.3。

A.4设备

A.4.1培养箱

见5.3.2。

A.4.2灭菌锅

见5.3.3。

A.4.3微生物载体

微生物载体是用符合ISO2267的棉织物制备的样块，尺寸为1.0cmX1.0cm或者直径为2.5cm，按照5.3.4的描述，使用前用蒸馏水煮3次，灭菌，室温下干燥并保持无菌状态。

A.4.4移液器

见5.3.5。

A.4.5电子混匀器

见5.3.6。

A.4.6离心机

见5.3.7。

A.4.7负载

见5.3.8。

A.4.8水温测试设备

见5.3.9。

A.4.9用水量测试设备

见5.3.10。

A.5试验

A.5.1 试验原理

含菌试验样块用于测定家用洗衣过程中微生物的减少和可能存在的微生物交叉污染。

除非另有说明，试验条件、材料、设备和仪器应符合IEC60456=2010的要求。

A.5.2洗衣机的准备

见6.2。

A.5.3试验微生物和含菌试验样块的准备

含菌试验样块可以现用现准备，也可以使用备用品。

A.5.3.1培养物

试验用微生物和保藏培养物应按照以下方法准备和保藏。

A.5.3.1.1酿酒酵母工作培养物

酿酒酵母工作培养物的制备流程与6.3.1.1中白色念珠菌的制备过程相同。

A.5.3.1.2酵母菌的制备

按照6.3.1.2中白色念珠菌的方法制备。

A.5.3.1.3荧光假单胞菌和阿尔莱特葡萄球菌工作培养物的制备

荧光假单胞菌和阿尔莱特葡萄球菌工作培养物的制备按照6.3.1.3中恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌的制备方法。

A.5.3.1.4菌悬液

按照6.3.1.4中恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球的方法制备。

A.5.3.2含菌试验样块

A.5.3.2.1微生物载体

见A.4.3。

A.5.3.2.2载体的接种

每个菌种每次试验使用5个微生物载体。

微生物载体浸人试验用微生物菌悬液中，用无菌镊子夹着反复旋转，使载体完全浸湿并除去所有气泡。

微生物载体在菌悬液中放置20min〜30min，然后用镊子转移至开盖培养皿中，置于培养箱中至少干燥3h。细菌干燥温度为（36±1）°C，酵母菌干燥温度为（30±l）°C。

注：为了保证干燥3h后的效果，有必要确保培养箱内部的最小湿度。

每个接种的载体用无菌镊子分别转移至袋子中，每种微生物的5个载体应放置在5个棉袋中。含菌试验样块放置在有盖培养皿中，置于室温下保存，干燥后一周内使用。

如果使用商品化含菌试验样块，使用前应保存在冰箱中，每次试验中每个测试菌种使用的共5个含菌试验样块应用无菌镊子分别转移至5个棉布袋中。

另外，每种微生物接种两个载体用于有效性分析（见A.5.5）。

A.5.4主试验

A.5.4.1概述

见6.4.1。

A.5.4.2测试微生物的回收

测试程序结束之后，为了确定含菌试验样块上微生物的数量，将每个含菌试验样块置于10mL中和剂（见A.3.3.10）中，用电子混匀器（见5.3.6）混合1min。混合溶液在室温下放置60min，然后再次用电子混匀器混匀1mm，平板计数。

A.5.4.2.1微生物平板计数

为了准备系列梯度稀释（图A.1）,需要使用无菌枪头。1mL含菌试验样块悬液加人9mL中和剂（A.3.3.10）中。将第一个稀释度的溶液混合均匀，然后将其中1mL再转移至第二个稀释度中。依次稀释至V\每个稀释度中取0.1mL用涂布棒在平板上旋转涂布。细菌在大豆胰蛋白胨琼脂（A.3.3.1）平板上涂布，酵母菌在沙氏葡萄糖琼脂平板上涂布（A.3.3.2）,每个平板使用单独的无菌涂布棒。

酿酒酵母在（30±1）°C条件下，荧光假单胞菌和阿尔莱特葡萄球菌在（36±1）1条件下培养1d〜

5do

1mL 1mL 1mL 1mL

1 y-3 f/~4 5

10mL中和剂9mL中和剂 9mL中和剂 9mL中和剂 9mL中和剂

图A.l系列稀释液的制备过程

微生物计数应选择合适的合适的稀释度，每个平板上的菌落总数在15〜300之间的可用于进一步分析，其他平板弃之不用。

A.5.5有效性

A.5.5.1试验前微生物数